Clonagem de genitores pisifera e proteômica diferencial durante a aquisição de competência embriogênica em palma de óleo (Elaeis guineensis Jacq.)

Abstract

O presente trabalho objetiou avaliar respostas de genitores Pisifera de dendezeiros (Elaeis guineensis Jacq.) quanto à capacidade de regeneração de plantas por embriogênese somática (ES), além de identificar proteínas envolvidas durante o processo de aquisição de competência embriogênica em híbridos Tenera contrastantes para a embriogênese somática. Num primeiro experimento, explantes foliares de quatro genótipos adultos de dendezeiro da variedade Pisifera (A251424, A251427, A251512 e A251513) foram submetidos à indução de ES utilizando-se o meio de indução (MI), composto pelos sais e vitaminas de Murashige e Skoog (MS), suplementado com 30 g.L-1 de sacarose, 0,5 g.L-1 de glutamina, 0,5 g.L-1 de caseína hidrolisada, 2,5 g.L-1 de carvão ativado, 450 µM de Picloram e gelificado com 2,5 g.L-1 de phytagel. O material permaneceu nesta condição por 360 dias, com subcultivos a cada 150 dias. Posteriormente, o material foi transferido para o meio de multiplicação de calos (MM), composto por 40 µM de Picloram, 10 µM de 2-isopenteniladenina (2iP) e 2,5 g.L-1 de phytagel, onde permaneceu por mais 90 dias. Em seguida, os calos foram colocados em meio de diferenciação (MD) formado por 12,3 µM de 2iP, 0,54 µM de ácido naftalenoacético (ANA) e de 2,5 g.L-1 de phytagel. Depois de diferenciados, os embriões somáticos foram transferidos para o meio de regeneração, desprovido de reguladores de crescimento e acrescido de 2,5 g.L-1 de phytagel e carvão ativado. Durante todo o processo, o material foi avaliado morfo e histoquimicamente para melhor caracterizar as etapas. Num segundo experimento, a proteômica diferencial de dois híbridos Tenera var. B351733 (responsivo à ES) e var. B352933 (não-responsivo à ES) foi avaliada durante o processo inicial (14 dias) e tardio (150 dias) da aquisição de competência embriogênica em dendezeiro, etapas caracterizadas pelo início de formação de calo primário e calo embriogênico, respectivamente. As proteínas extraídas foram quantificadas por Bradford e analisadas por eletroforese bidimensional (2-DE). Proteínas consideradas diferenciais pelo programa de análise de imagem Image Master Platinum foram identificadas por espectrometria de massa. A sequência foi obtida no banco NCBI por meio do GI (Gene Identifier) de cada proteína identificada nestes tempos. Com as sequências, adicionalmente foi realizada a anotação funcional destas proteínas nas plataformas AgBase e Revigo, sendo o gene onthology (GO) de cada proteína obtido. A partir dos dados também foram gerados gráficos dos processos biológicos em cada tempo. Verificou-se que o genótipo Pisifera A251424 foi o mais responsivo ao processo de ES quando comparado aos demais, com maior formação de calos ao longo do tempo (45%). Na etapa MM, calos com até 10,6 mg de massa fresca foram os que apresentaram maior incremento de biomassa em relação aos calos de maior peso inicial. Com 90 dias em meio MD, calos embriogênicos se diferenciaram em embriões somáticos e até 130 dias após, clusteres de embriões somáticos surgiram nesta condição. Nas análises morfo-anatômicas e histoquímicas, quatro tipos de calos foram observados na etapa MI, sendo o nodular amarelado, com maior adensamento de amido nesta etapa, o único a progredir até a formação de embriões somáticos. Na análise proteômica das variedades Tenera, 52 proteínas diferencialmente abundantes no tempo 14 dias foram reveladas, incluindo 17 proteínas aumentadas e 14 diminuídas no genótipo responsivo, em relação ao genótipo não-responsivo. Já aos 150 dias de indução, 74 proteínas reguladas foram detectadas, incluindo 19 aumentadas e 13 diminuídas no genótipo responsivo em relação ao não-responsivo. Um total de 40 proteínas exclusivas foram observadas no genótipo responsivo aos 150 dias de indução, enquanto que o genótipo não-responsivo apresentou somente duas. A anotação funcional evidenciou uma menor diversidade dos processos biológicos aos 14 dias para o genótipo responsivo, e aos 150 dias estes processos apresentaram maior diversidade, quando comparados ao não-responsivo. A análise 2-DE e ontologia gênica permitiram a identificação de dez proteínas importantes relacionadas com a aquisição de competência embriogênica, entre elas a isoenzima catalase 2 (spot 254), mono-dehidro-ascorbato-redutase isoforma cloroplástica X2 (spot 150), subunidade beta da pirofosfatofrutose-6-fosfato-1- fosfotransferase (spot 338). De modo geral, os resultados obtidos envolvendo a ES, morfoanatomia, histoquímica e a análise proteômica, aliada à bioinformática (anotação funcional), permitiram compreender melhor a propagação in vitro em dendezeiro, dando novos subsídios para pesquisas futuras rumo a um melhor entendimento sobre os processos de propagação clonal da espécie por embriogênese somática.