Engenharia metabólica em Pichia pastoris para produção de L-ácido lático a partir de glicerol, um resíduo da indústria de biodiesel

Abstract

O descarte de resíduos plásticos no meio ambiente associado à dependência de insumo petroquímico para produção dos mesmos tem gerado grande preocupação, levando à busca constante pelo desenvolvimento de tecnologias verdes renováveis. Segundo a Plastics Europe, em 2016, 25,8 milhões de toneladas de resíduos de plástico pós-consumo acabaram nos fluxos oficiais de resíduos. Destes, 69,2% foi recuperado através de processos de reciclagem e recuperação de energia, enquanto 30,8% continuaram a ser depositados em aterros sanitários. Uma alternativa a utilização de plásticos derivados de petróleo é a produção de plásticos biodegradáveis, como o PLA -poli(ácido lático)-, pois além de ter tempo de degradação diminuído, é produzido a partir de fontes renováveis em bioprocessos estabelecidos, como exemplo, a fermentação microbiana. Dentre os diferentes microrganismos utilizados no estabelecimento destes bioprocessos, a utilização de leveduras é vantajosa, por produzirem metabólitos, proteínas recombinantes e permitir manipulação gênica para otimização. A levedura metilotrófica Pichia pastoris tem sido bastante utilizada em processos fermentativos por atingir altas densidades celulares e produzir poucos co-produtos. Além disso, esta é capaz de utilizar glicerol como única fonte de carbono, principal resíduo da indústria do biodiesel. Porém, não é capaz de produzir ácido lático, monômero utilizado na síntese de PLA. Assim o presente estudo teve como objetivo a construção de cepas geneticamente modificadas de P. pastoris capazes de produzir ácido lático utilizando glicerol como substrato. Para isto, o gene codificador da enzima lactato desidrogenase bovina (Bos taurus) foi inserido no genoma de P.pastoris, permitindo que a cepa X-33 produzisse ácido lático. Embora P. pastoris seja conhecida por seu metabolismo respiratório, as fermentações em batelada realizadas com baixa oxigenação aumentou a produção de ácido láctico em 20%, indicando que nesta situação o metabolismo fermentativo prevaleceu. Além disso, um novo transportador putativo de lactato de P. pastoris denominado PAS, foi identificado por similaridade de pesquisa com o transportador de lactato de Saccharomyces cerevisiae Jen1p. Ambos os transportadores heterólogos e homólogos, Jen1p e PAS, foram avaliados em uma cepa que já continha atividade LDH. As fermentações em batelada das cepas de P. pastoris com o transportador de lactato foram realizadas em condições aeróbicas seguida por uma fase de oxigênio limitado, nesta a produção de ácido lático foi maior. Os resultados mostraram que a cepa contendo o transportador PAS apresentou o maior rendimento, 0,7 g/g (ácido lático/ glicerol).