Nova classe de inibidor de serinopeptidase presente na peçonha do escorpião Tityus obscurus

Abstract

O interesse na caracterização de novos inibidores de peptidases (PIs) tem aumentado nas últimas décadas devido a seu potencial uso na prevenção e tratamento de diversas doenças humanas. Muitos PIs já foram caracterizados de animais venenosos e peçonhentos, como anêmonas, serpentes, anuros e, mais recentemente, escorpiões e aranhas. Nesse estudo apresentamos uma nova classe de inibidor de serinopeptidase isolado da peçonha do escorpião Tityus obscurus (Buthidae), responsável por muitos casos de envenenamento na região Amazônica. Denominado ToPI1, ele foi purificado da peçonha bruta por RP-HPLC, e sua sequência foi determinada por MALDI-ISD e pela análise de seu precursor, obtido da biblioteca de cDNA da glândula de peçonha do T. obscurus. O ToPI1 compartilha menos de 45% de similaridade com outros peptídeos descritos em bancos de dados públicos. Ainda assim, todas eles são bloqueadores ou possíveis bloqueadores de canais de K+, não havendo similaridade com nenhum PI descrito até o momento. O peptídeo sintético oxidado (ToPI1s), obtido usando a estratégia Fmoc/t-butila, foi ativo contra tripsina em ensaios cromogênicos, mostrando-se do tipo tight-binding, e também por Ressonância Plasmônica de Superfície (SPR), em um biossensor Biacore 3000, onde apresentou afinidade picomolar por tripsina imobilizada. Os resultados indicaram que a formação do complexo ToPI1:tripsina é espontânea, endotérmica e favorecida por um aumento de entropia. Experimentos em SPR indicaram que o ToPI1s se liga ao sítio ativo da tripsina, semelhante aos inibidores canônicos. O ToPI1s não inibiu quimotripsina mesmo em concentrações elevadas. Também não reduziu a viabilidade de células tumorais HeLa (de câncer cervical humano) e B16F10 (de melanoma murino) nem de fibroblastos murinos não tumorais (NIH-3T3). Seu efeito foi mínimo ou nulo nas correntes de diferentes subtipos de canais de K+. O ToPI1s não causou alterações comportamentais e/ou fisiológicas visíveis em camundongos. A potente atividade inibidora de tripsina do ToPI1s em conjunto com esses resultados negativos o tornam um candidato atrativo para futuras aplicações terapêuticas. Análises por dicroísmo circular (190-260 nm) sugerem ausência de diferenças de estrutura secundária entre o ToPI1 nativo e o ToPI1s, com predominância de estruturas do tipo β (folhas-β e voltas-β) e desordenadas, e menor quantidade de α-hélice. O ToPI1s mostrou-se bastante estável, não desnaturando na faixa de pH 3,0-9,0 mesmo a 95°C. Dois análogos do ToPI1 foram sintetizados, os quais estão sob processo de proteção à propriedade intelectual.