Etude des événements moléculaires de la gamétogenèse de Plasmodium berghei par des approches protéomiques

Abstract

Na história da medicina, a malária é uma das doenças parasitárias mais graves e distribuídas que afetam seres humanos. A doença é causada por parasitas do gênero Plasmodium. A malária de roedores é utilizada comumente como modelo por permitir a combinação de experimentos in vivo e in vitro, além de estudos por genética reversa. Embora a gametogênese dos estágios sexuais de Plasmodium seja um passo essencial da transmissão da malária, dados moleculares sobre a reorganização nuclear, montagem do flagelo e sua regulação na gametogênese estão incompletas. A ATPase cinesina-8 de P. berghei é uma proteína motora sugerida como um importante componente para a gametogênese macho. Os gametócitos com o gene kin8 interrompido (Δkin8) são semelhantes morfologicamente aos tipos selvagens (WT), enquanto que na gametogênese existe disfunção que tornam as células Δkin8 incompetentes para gametogênese completa e incapazes de exflagelar. Nos esforços para melhorar o conhecimento sobre a exflagelação de gametas, fizemos experimentos quantitativos de proteômica e fosfoproteômica com gametócitos WT e Δkin8. A amostra enriquecida de gametócitos do sangue murinho no tempo T0 foi induzida a exflagelação por ácido xanturênico e colhida no tempo T7 e T15 min. A quantificação relativa entre amostras foi realizada com uso de peptídeos marcados por iTRAQ na triplicata biológica independente e analisados por nanoLC/MS-MS Orbitrap Elite Mass Spectrometer após enriquecimento TiO2. Os dados foram processados através do softwares Patternlab for Proteomics e Blast2GO. Em parasitas WT, 443 proteínas e 206 fosfoproteínas foram identificados a partir de 2.617 peptídeos. Em parasitas Δkin8, 530 proteínas e 218 fosfoproteínas proteínas foram identificadas a partir de 3.198 peptídeos. A produção de gametas é regulada por fosforilações nas duas condições celulares. Entre os processos biológicos da Ontologia de Genes, aqueles relacionados a tradução de RNA, e biossíntese de DNA e proteínas foram as que mais se destacaram e mais regulados na gametogênese. Foi observado também que a glicólise e a resposta ao estresse ambiental foram mais notável principalmente no início da diferenciação celular. Para Δkin8, a desorganização de microtúbulos dos axonemas e fusos mitóticos é causa provável da supressão de proteínas motoras (cinesina -8, -13 e dineína) como também pela superexpressão de proteínas de organização do braço interno e braço radial. Observamos importante diminuição de unidades de nucleossomos e aumento de proteínas envolvidas com a desorganização da divisão nuclear. Quando comparado com o WT, no mutante houve maior expressão de proteínas envolvidas no complexo proteassoma dependente de ubiquitina e menor quantidade de algumas proteínas interferentes no metabolismo energético e egresso. A análise do Δkin8 traz novas informações sobre a exflagelação e mal funcionamento do microgameta mutante. Em conclusão, a gametogênese exige manifestamente a expressão de proteínas e sua regulação por fosforilações para a produção de energia na diferenciação dos gametas. A Cinesina 8 é essencial para a gametogênese masculina normal como também para a montagem de axonemas em P. berghei, e seu estudo fornece informações quanto a organização celular e biologia de Plasmodium.