Investigação da variação da metilação de DNA em macrófagos de camundongos infectados com L.(L.)amazonensis e L.(L.)infantum

Abstract

Leishmaniose é uma doença complexa que envolve diversas sinalizações principalmente via resposta imune inata através dos macrófagos. O estudo da doença é normalmente realizado in vitro, entretanto há uma grande variedade de macrógfagos usados, formas do parasita, espécies do parasita e linhagens de animais. Sabe-se que o parasita Leishmania spp. de alguma forma consegue subverter o tipo de polarização de macrófagos, desta forma manipula etapas imunes essenciais do hospedeiro, permanecendo e proliferando dentro do seu organismo. O padrão de citocinas produzido por macrófagos tem retroalimentação com linfócitos T, citocinas como IL-12, INF- e IL-6 que possuem perfil pró-inflamatório e estimulam linfócitos Th1, os quais estão associados com animais de linhagens resistentes como C3H/he. Por outro lado o perfil de citocinas anti-inflamatório tende a estimular linfócitos Th2, que estão bem associados a animais susceptíveis como Balb/c. Trabalhos mostram que diversos patógenos são capazes de manipular diferentes etapas da resposta imune inata, autores já descrevem que parasitas, vírus e bactérias são capazes de modificar etapas epigenéticas do hospedeiro. Epigenetica envolve mecanismo capazes de alterar e coordenar a expressão dos genes, um deste mecanismos é a metilação de DNA. Metilação de DNA é uma modificação química no carbono 5 de citosinas, tal modificação é encontrada normalmente em vertebrados e invertebrados, em situações fisiológicas e patológicas. Existem diversas metodologias para verificação dos níveis de metilação de DNA, a técnica de RRBS (Reduced representation bisulfite sequencing) é uma técnica barata, acessível e comparável as demais metodologias. O presente trabalho investigou os sítios de metilação de DNA em macrófagos peritoneais de duas diferentes linhagens (Balb/c e C3H/he), recuperados com lavagem ou estimulo por Tioglicolato de sódio. As células de ambas linhagens sem estímulo foram infectadas com L. infantum e L. amazonenses; as células com estímulo foram infectadas apenas com L. amazonenses. Após o período de 72 horas o DNA das células foi extraído e purificado para a preparação de bibliotecas de RRBS e sequenciamento em Hi-seq 2500. A análise das sequências foi feita pela ferramenta Rnbeads, que realizou as comparações – infecção x controle; linhagem resistente x susceptível; e macrófagos estímulo x sem estímulo. Através da distribuição beta e redução dimensional geradas pela ferramenta sugere-se que há diferenças consistente entre células recuperadas por Tioglicolato e células recuperadas com lavagem. As células estimuladas apresentam menor concentração de sítios metilados em regiões como promotores, genes e tiling. Entre animais resistentes (C3H/he) e susceptíveis (Balb/c) também foi observado que animais Balb/c tendem a ter menor concentração de metilação de DNA quando comparados a C3H/he, tal perfil não é devido a infecção. Apesar da sutil diferença na metilação de DNA entre infecção e controle, as linhagens demonstraram padrões opostos de metilação de DNA. Não foi possível distinguir mudanças nos sítios de metilação entre Leishmaniose cutânea e visceral. O presente trabalho sugere que há diferenças na metilação de DNA, sendo sutil no status de infecção e controle, moderado em animais resistentes e susceptíveis, e intenso entre células estimuladas e não estimuladas, e tais modificações são vistas em regiões importantes do genoma como promotores.