Produção de hemicelulases recombinantes e aplicação na hidrólise do bagaço de cana de açúcar

Abstract

A lignocelulose é o principal componente da biomassa vegetal, sendo constituída por celulose, hemicelulose e lignina. A xilana é o principal componente da hemicelulose e para a sua completa degradação é necessário a ação cooperativa de um sistema composto por várias enzimas, incluindo endo-xilanases (XYN), β-xilosidases (XYL) e α-L-arabinofuranosidases (ABF). No presente trabalho, foi realizada a produção de hemicelulases recombinantes e a aplicação na hidrólise do bagaço de cana-de-açúcar (BCA) pré-tratado por explosão a vapor. As primeiras enzimas produzidas foram duas XYLs do fungo Humicola grisea var. thermoidea, sendo esse o primeiro trabalho a reportar a caracterização de genes de XYLs de H. grisea, bem como, a sua expressão heteróloga e caracterização bioquímica. Os dois genes, hxylA e hxylB, foram identificados a partir do genoma de H. grisea, um com 984 pb e outro com 1617 pb, respectivamente. Nenhum íntron e peptídio sinal foi encontrado e o domínio catalítico de GH43 estava presente em ambas. Os cDNAs correspondente as duas enzimas foram utilizados para a transformar duas linhagens de Pichia pastoris, GS115 e SMD1168. Uma otimização da produção da enzima denominada HXYLA foi realizada por meio de planejamento experimental 23. A influência da densidade celular inicial, concentração de metanol e fonte de nitrogênio foi avaliada e o parâmetro mais significativo para a produção foi a concentração de metanol. A enzima HXYLA purificada foi utilizada para a realização da caracterização enzimática quanto ao pH e temperatura ótimos (7,0 e 50 °C), efeito de íons e reagentes químicos na atividade de HXYLA, substrato específico e parâmetros cinéticos. A enzima HXYLA apresentou atividade de β- xilosidase e α-L-arabinofuranosidase, sendo uma enzima bifuncional e altamente tolerante a xilose, com elevado valor de Ki (350 mM). Além das β-xilosidases, foi produzida e purificada uma endoxilanase (HXYN2) recombinante de H. grisea a partir de um clone de P. pastoris obtido pelo grupo de pesquisa do laboratório de Biotecnologia de Fungos (LBF/UFG). Além dessas hemicelulases, uma α- L-arabinofuranosidase (ABF3) de Penicillium purpurogenum teve seu cDNA introduzido em P. pastoris e a enzima foi produzida com sucesso. Após a produção hetoróloga das enzimas, foi utilizado um planejamento experimental 23 para avaliar a melhor formulação contendo as três hemicelulases recombinantes (HXYN2, ABF3 e HXYLA) para a hidrólise do BCA pré-tratado por explosão a vapor, sendo possível estabelecer uma mistura capaz de realizar a conversão da fração residual de xilana em xilose, sendo a bioconversão eficiente da fração de xilana do BCA uma etapa imprescindível para o aproveitamento da xilose. A melhor formulação contendo as três hemicelulases recombinantes foi obtido com a menor concentração de ABF3, sendo que essa enzima foi a que exerceu efeito mais significativo durante a hidrólise do BCA. Além disso, o coquetel contendo as hemicelulases recombinantes foi utilizado para suplementar uma mistura de celulases comerciais aumentando significativamente a liberação de glicose a partir do BCA, o que mostrou a capacidade das hemicelulases de melhorar a digestibilidade de celulose e tornar o processo de hidrólise mais eficiente. Nossos resultados mostram o potencial de atividades acessórias para aumentar a hidrólise enzimática, tais como XYNs, ABFs e XYLs, que estão ausentes ou presentes em pequenas proporções nas celulases comerciais.