Caracterização morfoanatômica e bioquímica da germinação, sistemas de conservação ex situ e indução de calos para a embriogênese somática de pinhão-manso (Jatropha curcas L.)

Abstract

O presente trabalho teve por objetivo caracterizar bioquímica e histoquimicamente a germinação, desenvolver estratégias para a conservação de germoplasma, bem como induzir e caracterizar a calogênese in vitro de pinhão-manso visando o desenvolvimento de protocolos para a embriogênese somática. Para os estudos de germinação, as sementes foram desinfestadas, inoculadas in vitro e mantidas na presença de luz. As avaliações de desenvolvimento e as coletas para as análises morfoanatomicas, histoquímicas e bioquímicas da germinação foram realizadas ao longo do período de cultivo de 30 dias. A caracterização anatômica foi realizada com o auxílio do corante Azul de Toluidina e para as análises histoquímicas foram utilizados Sudan IV, para compostos lipídicos, Xylidine Ponceau, para proteínas totais e Reagente de Schiff/ ácido periódico – PAS, para polissacarídeos neutros. Para as análises bioquímicas, os materiais oriundos dos diferentes períodos de germinação foram avaliados quanto a percentagem de açucares solúveis totais (AST) e amido via método colorimétrico, de proteínas em aparelho CNS, além da quantificação de lipídios via técnica de derivatização in situ em GC-MS. Anatomicamente, as sementes apresentaram endosperma com células isodiamétricas, paredes delgadas e conteúdo celular visível em formas de gotas de lipídeos e corpos proteicos; os cotilédones e folhas com epiderme simples e mesofilo composto por parênquima paliçádico e lacunoso e o hipocótilo com cilindro vascular do tipo eustelo. Histoquimicamente, evidenciou-se que os lipídeos e as proteínas aparecem como o principal material de reserva no endosperma. As análises bioquímicas confirmaram a maior presença de ácidos graxos em relação aos demais compostos de reserva no endosperma, principalmente os ácidos oleicos e linoleicos. Já com a formação da plantula, o amido apareceu como a principal composto de reserva. Para os estudos de conservação, verificou-se a umidade inicial das sementes e, em seguida, se realizou o processo de dessecação em sílica-gel por 0, 24, 48, 96 e 192 horas. Após cada tempo de dessecação, a umidade foi novamente avaliada e as sementes armazenadas em diferentes condições de temperatura (25ºC, 6ºC, -20ºC e -196°C) por 0, 180, 360 e 720 dias. Transcorrido o tempo de conservação, as sementes foram germinadas in vitro e a germinação avaliada após 30 dias de cultivo. Análises de condutividade elétrica foram realizadas nas sementes armazenadas em todos os tratamentos. Para a criopreservação de eixos embrionários, inicialmente realizou-se a extração dos eixos em condições assépticas e a hidratação dos mesmos por 1 hora em placa de petri contendo papel filtro umedecido com água destilada estéril. Posteriormente, aplicou-se os tempos de dessecação pela exposição dos eixos ao fluxo de ar da câmara de fluxo laminar por 0, 2, 4, 6, 8 e 10 horas. Logo após os tempos de dessecação, a umidade dos eixos embrionários foi aferida e estes foram imersos em nitrogênio líquido por 0, 2, 30, 90, 180 e 360 dias. Após o período de conservação, foi realizado o teste de germinação in vitro, com avaliação após 30 dias de cultivo. As sementes de pinhão-manso toleraram a dessecação e se mantiveram viáveis com até 4,3% de umidade. Porém, não toleraram o armazenamento por período de até 720 dias em todas as temperaturas avaliadas, o que sugere um comportamento intermediário das sementes. O teste de condutividade elétrica foi eficaz na avaliação da qualidade das sementes, apresentando alta correlação entre a quantidade de íons observados e a percentagem de germinação. Com relação a criopreservação dos eixos embrionários, verificou-se uma taxa média de 90% de germinação, após 360 dias de armazenamento, quando estes apresentavam umidade em torno de 8%, e foi considerado a melhor técnica de conservação a longo prazo desta espécie. Por fim, explantes de hipocótilo e folhas cotiledonares de plantas cultivadas in vitro foram induzidos a calogênese em meio de MS suplementado com 2,4-D e picloram (0, 50, 100, 200 e 400 μM) em combinação ou não com 50 μM de cinetina, sendo mantidos em condição de luz ou escuro por 30 e 60 dias. Após os tempos foi avaliado a percentagem de formação de calos, textura dos calos (friável, semicompacto e compacto), além da coloração predominante. Amostras de calos com 60 dias de cultivo foram incluídas em metacrilato e caracterizados anatomicamente. Explantes de pinhãomanso, constituídos por hipocótilo e folhas cotiledonares foram responsivos a indução de calos, apresentando 100% de explantes com calos em vários tratamentos, principalmente na presença de picloram. O tratamento contento apenas cinetina promoveu a formação de calos friáveis em folhas cotiledonares e calos friáveis e semi-compactos em explantes de hipocótilo. O 2,4-D foi mais eficiente na formação de calos compactos com aspecto globular, enquanto o picloram induziu de calos semi-compactos e friáveis e de grande volume. Calos embriogênicos foram observados em hipocótilos e folhas cotiledonares cultivados com 200 e 400 μM de picloram e 2,4-D, preferencialmente, no escuro. O presente trabalho contribuiu com informações relevantes sobre a caracterização da germinação de sementes de pinhão-manso. Esclareceu e determinou a melhor técnica de conservação ex situ para a espécie, sugerindo a mudança da classificação das sementes de ortodoxas para intermediarias. E no estudo de calos, propiciou várias informações a respeito da calogênese em pinhão-manso que servirão de subsídios para futuros trabalhos de embriogênese somática para a espécie.