Produção de novos anticorpos Anti-CD20 na forma de FvFc em células de mamíferos

Abstract

Os anticorpos monoclonais são glicoproteínas especializadas com capacidade de reconhecer outras moléculas (antígenos). Eles são ferramentas importantes na clínica e biotecnologia e têm sido úteis no diagnóstico e tratamento de doenças infecciosas, inflamatórias, imunológicas e neoplásicas, assim como no estudo da interação patógeno/ hospedeiro, e na detecção e quantificação de diversas moléculas. Os anticorpos monoclonais murinos (mAb) apresentam aplicações terapêuticas limitadas devido à sua natureza heteróloga, que pode gerar respostas imunogênicas e consequente a perda de atividade. A incorporação de técnicas de biologia molecular, e engenharia genética e proteomica tem aumentado a produção e utilização de anticorpos monoclonais, desenvolvendo técnicas como hibridoma, quimerização, e humanização de anticorpos monoclonais totalmente humanos. Ao longo dos últimos anos, novas gerações de anticorpos monoclonais (mAbs) anti-CD20 têm sido desenvolvidas para potenciais vantagens sobre a clássica e primeira geração do mAb rituximabe, Apesar de seus sucessos, nem todos os pacientes respondem ao tratamento com rituximabe e quase todos tem um recaída em seu tratamento. Assim, melhorar as propriedades deste anticorpo para melhorar a sua eficácia é muito desejável. Comparado com o rituximabe, novos mAbs têm atividade anti-tumor melhorada, resultante do aumento da citotoxicidade dependente do complemento (CDC) e / ou citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC). Neste aspecto, cultivos de células animais são os sistemas de expressão para essas proteínas preferenciais, que requerem modificações póstradução. É assim que o grupo de Imunologia Molecular da Universidade de Brasília tem se interessado pela produção de proteínas heterólogas de interesse clínico em células de mamíferos desde 2001. Este trabalho teve como objetivo a produção de novos anticorpos anti CD-20 na forma de fragmento recombinante FvFc em sistema de expressão heteróloga em células de ovário hamster chinês (CHO-K1) e em células de rim embrionário humano (HEK-293). A eficiência de transfecção para ambas as linhagens celulares foi avaliada comparativamente, bem como a expressão transiente. Os resultados indicam as células de mamífero como um sistema ótimo para a produção de proteínas heterólogas, Os segmentos dos genes correspondentes a três versões recombinantes humanizadas homologas ao anticorpo monoclonal quimérico rituximabe obtidas por CDR graffting (Zaparolli 2015) A, O, e L) e uma versão híbrida elecionada por VL shuffling (H), foram amplificados e clonados num vetor de expressão para células de mamífero. Os resultados mostraram uma eficiência de transfecção e produção de anticorpos menor na linhagem de células CHO-K1 em comparação com HEK-293, embora estas fossem estáveis para a produção de anticorpo em transfectomas estáveis. Os anticorpos recombinantes produzidos foram purificados por cromatografia de afinidade, quantificados por ELISA, e analisados em relação a sua qualidade por SDS-PAGE, eletroforese capilar (Bioanalyzer) e Western Blotting. Os resultados deste projeto têm demostrado que fomos bem sucedidos na expressão e produção das construções humanizadas do anticorpo anti-CD20.