Silenciamento do canal de potássio Eag1 potencializa efeitos da temozolomida em células U-87 MG de glioblastoma multiforme

Abstract

Glioblastoma multiforme (GBM) é o tipo mais comum de tumor cerebral primário em seres humanos adultos, representando aproximadamente 55% dos casos. O processo tumoral desenvolve-se de maneira agressiva e as opções terapêuticas são limitadas. O protocolo de tratamento padrão inclui radioterapia em combinação com temozolomida (TMZ), combinado com excisão cirúrgica quando possível. Apesar de alguns avanços no tratamento de GBM, o tempo de sobrevida dos pacientes diagnosticados com esse tipo de glioma é de aproximadamente 14,5 meses. A interferência de RNA (RNAi) é um mecanismo de silenciamento de genes e está entre as abordagens promissoras para a terapia do câncer. Assim, utilizou-se a metodologia de RNAi para supressão do canal de potássio Ether à go-go 1 (Eag1) em células de glioblastoma da linhagem U-87 MG. Este alvo molecular tem papel relevante na tumorigênese de vários tipos de câncer, auxiliando na proliferação celular e metástases. O estudo realizado na presente dissertação examinou o papel de Eag1 na viabilidade das células de glioma tratadas com TMZ. Inicialmente, realizaram-se ensaios experimentais com concentrações de TMZ (125, 250 ou 500 µM) e pontos temporais (24h, 48h, ou 72h). A viabilidade celular do glioma foi determinada via ensaio de 3-(4,5)-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT). No ponto temporal de 72h e concentração de 250 µM, o fármaco TMZ diminuiu a viabilidade das células em aproximadamente 50%. Com base nesse resultado da curva dose-resposta, estabeleceu-se a concentração do quimioterápico para a execução dos ensaios seguintes. Testaram-se, também, os efeitos do bloqueador de canal de potássio astemizol (ATZ 2,5 µM, 5 µM e 10 µM) ou vetor de expressão de shRNA denominado pKv10.1-3 (0,2 μg) sobre a viabilidade do glioma nos tempos de 24, 48 e 72 horas. Este vetor expressa grampos curtos de RNA (shRNA) direcionados à sequência de RNAm de Eag1 5'-GTCCACTTGGTCCATGTCCAG-3'. Além disto, avaliou-se os efeitos causados por ATZ 5 µM ou por pKv10.1-3 (0,2μg) em combinação com TMZ 250 µM, no tempo de 72 horas. O tratamento com pKv10.1-3 potencializou, de maneira significativa, a redução na viabilidade celular causada por TMZ sobre células de glioma (77,2% versus 47,9%). Verificou-se, ainda, que a inibição de Eag1 por astemizol (5 µM) ou pKv10.1-3 aumenta a taxa de apoptose causada por TMZ, conforme ensaio de citometria de fluxo. pKv10.1-3 (0,2 µg) reduziu significativamente o conteúdo de RNAm de Eag1, para 0,57 vezes em relação ao valor observado no grupo controle negativo pScramble (0,2 µg), conforme resultado de RT-qPCR. Quanto à proteína Eag1, esta mostrou-se elevada nas células de glioblastoma humano da linhagem U-87 MG. Os tratamentos experimentais causaram redução do conteúdo desta proteína, detectada por imunocitoquímica. Portanto, os dados do presente estudo revelam que Eag1 desempenha papel na viabilidade das células de glioma, além disso, mostraram que a supressão desse canal potencializa a ação da TMZ em células U-87 MG de glioblastoma multiforme.