Processo de obtenção e caracterização de proteases extracelulares expressas por Penicillium restrictum

Abstract

Proteases constituem um dos grupos de enzimas industriais mais importantes, com participação na indústria de detergentes, couro, alimentos e medicamentos. A indústria de detergentes é uma grande consumidora de enzimas hidrolíticas. Novas metodologias que possibilitem a purificação de biomoléculas são de grande interesse para a indústria pelas suas potenciais aplicações. O objetivo principal deste trabalho foi produzir, purificar e caracterizar proteases extracelulares de Penicillium restrictum cultivado sob fermentação submersa. A cepa de Penicillium restrictum isolada do solo do Cerrado foi capaz de produzir proteases extracelulares após 7 dias de cultivo a 28°C e 150 rpm em meio contendo farelo de trigo. Após os 7 dias de cultivo o filtrado do meio fermentado foi submetido ao processo de ultrafiltração em membrana de 100 kDa e a fração ultrafiltrada foi adicionada ao SMDFA em diferentes condições, sendo avaliada a purificação através de um planejamento fatorial 2³ com três repetições no ponto central. Os resultados mostraram que o SMDFA foi eficaz na partição das proteases presentes na fração < 100 kDa para a fase pobre em micelas, apresentando um coeficiente de partição (k) menor que 1 para todos os sistemas testados. O sistema 3 apresentou 80 de balanço de massas e 138,24% de rendimento. Baseado nos valores de k e nos valores do balanço de massa e do rendimento, o sistema contendo 10% Triton X114, 10% de caldo e separado a 31°C foi escolhido para dar continuidade ao processo de purificação da enzima de interesse. A fração pobre em micelas, foi ultrafiltrada em membrana de 30 kDa e o fator de purificação desta fração foi igual a 10,4. A purificação parcial de duas proteases extracelulares foi confirmada por SDS-PAGE seguido de zimograma. As bandas com atividade proteolítica revelaram pesos moleculares de aproximadamente 19,2 e 30,5 kDa. As proteases parcialmente purificadas apresentaram atividade máxima em pH 8,0 e a temperatura ótima foi estimada em 55°C. A enzima foi levemente inibida por PMSF e bastante inibida pelos íons metálicos Fe e Zn e o íon metálico Mg+2 induziu um aumento da atividade enzimática. As enzimas parcialmente purificadas foram aplicadas junto a detergentes comerciais apresentando potencial para possível aplicação na indústria de detergentes.