Caracterização de uma nova espécie de Potyvirus infectando mandioquinha-salsa

Abstract

A mandioquinha-salsa é uma planta propagada vegetativamente e durante o seu cultivo sucessivo pode ocorrer o acúmulo de patógenos de infecção sistêmica como vírus, resultando em decréscimo da produção. No Brasil, é comum observar plantas de mandioquinha-salsa apresentando sintomas de mosaico, mosqueamento e deformação foliar, semelhantes a infecção por vírus. Evidências de ocorrência de vírus infectando esta cultura já foram relatadas, porém nenhum estudo de identificação e caracterização havia sido realizado. O objetivo do presente trabalho foi caracterizar biológica, sorológica e molecularmente um vírus isolado de mandioquinha-salsa e desenvolver técnicas para a sua detecção. Um isolado de vírus foi obtido a partir de mandioquinha-salsa coletada para estudo de micropropagação, denominado isolado C17, e que foi selecionado para a caracterização. Este vírus causa em Nicotiana benthamiana, hospedeiro usado para manutenção, sintoma de deformação foliar, bolhosidades e mosaico. O isolamento biológico foi realizado a partir do extrato da planta original de mandioquinha-salsa infectada em Chenopodium quinoa. Este isolado apresentou círculo de hospedeiros restrito e foi transmitido por afídeos de maneira não persistente. Partículas virais foram purificadas e análise ao microscópio eletrônico revelou partículas alongadas e flexuosas, típicas de espécies de Potyvirus. Em gel de poliacrilamida, a capa protéica apresentou uma proteína com peso molecular de aproximadamente 33 kDa, que em teste de Western blotting foi reconhecida especificamente pelo anti-soro policlonal produzido contra a proteína da capa do isolado C17. O anti-soro produzido em coelho a partir de partículas purificadas apresentou alta especificidade e sensibilidade. Amostras de campo do banco ativo de germoplasma de mandioquinha-salsa da Embrapa Hortaliças foram avaliadas por ELISA. A detecção foi positiva em 93 % das amostras, demonstrando a grande aplicabilidade do antisoro em testes diagnósticos de amostras do campo. A porção 3´ terminal do genoma do vírus (1,7 kb) foi clonada por RT- PCR e sequenciada em sequenciador automático. A análise da seqüência nucleotídica do fragmento clonado revelou uma fase aberta de leitura incompleta (sem o códon de iniciação) que codifica uma parte da proteína NIb (polimerase viral) e capa protéica (CP), seguida de uma região 3´ não traduzida (3’ UTR). A sequência nucleotídica da CP e da 3' UTR apresentou baixa porcentagem de identidade com seqüências de outros potyvírus depositados em bancos de dados públicos. A maior porcentagem de identidade nucleotídica da CP foi de 63 % para Araujia mosaic virus e da seqüência de aminoácidos foi de 60 % para Narcissus late season yellows virus (NLSYV). A análise filogenética confirmou o agrupamento do C17 com o NLSYV e sugeriu que estes podem ter evoluído de um ancestral em comum. De acordo com o critério molecular para demarcação de espécies de Potyvirus, 82 % e 76 % de identidade na comparação da seqüência de aminoácidos e nucleotídeos da CP, respectivamente, o isolado C17 de mandioquinha-salsa pode ser considerado como uma nova espécie de vírus pertencente ao gênero Potyvirus, e o nome Arracacha mottle virus é proposto. Com o intuito de desenvolver uma ferramenta de detecção mais sensível que a sorologia, primers específicos foram desenhados e avaliados. Um par de primers mostrou excelentes resultados de especificidade e sensibilidade, sendo recomendados para o uso em testes de detecção em situações de necessidade de alta sensibilidade. A seqüência da região 3’ terminal genômica deste vírus foi bastante distinta dos demais potyvírus, portanto a clonagem do genoma para sequenciamento completo foi realizada. Utilizou-se a estratégia de RT-PCR com primers desenhados em regiões conservadas do genoma dos potyvírus mais próximos. Um total de dez clones foram obtidos, o que corresponde a 90% do genoma do vírus. A seqüência nucleotídica destes clones estão sendo determinados por primer walking. Até o momento, 70 % da seqüência de nucleotídeos do genoma já foi determinada. Este é o primeiro relato de identificação e caracterização de vírus infectando mandioquinha-salsa no Brasil. ________________________________________________________________________________ ABSTRACT

Arracacha plant is vegetatively propagated and during its continuous cultivation accumulation of systemic pathogens, such as viruses, can occur resulting in decreased production. In Brazil, it is common to observe arracacha plants with symptoms of mosaic, mottling and leaf deformation, similar to virus infection. Evidences of virus occurrence have been reported, but their identification and characterization were not carried out. The objective of this study was to characterize at the biological, serological and molecular level a virus isolated from arracacha, and to develop detection techniques. The virus isolate was obtained from an arracacha plant collected for micropropagation studies. This isolate was named C17, and selected for characterization. This virus caused in Nicotiana benthamiana plants, the maintenance host, symptoms of leaf deformation, blistering and mosaic. Biological isolation was conducted from the extract of the original arracacha plant inoculated in Chenopodium quinoa leaves. This isolate had a narrow host range and was transmitted by aphids in a non-persistent manner. Viral particles were purified and EM analysis revealed flexuous and filamentous particles, typical of Potyvirus species. A SDSPAGE revealed a coat protein of ca. 33 kDa, which was specifically recognized by the C17 polyclonal antiserum by Western blotting. This antiserum was produced in rabbits from purified particles, and was shown to be highly specificic and sensitive. Samples of the germplasm bank of arracacha of Embrapa Hortaliças were tested by ELISA. A total of 93% were positive for the presence of C17, demonstrating the applicability of this antiserum in diagnostic tests in field collected samples. The 3’ genomic portion of the virus genome (1,7 kb) was cloned by RT-PCR and sequenced in an automated sequencer. Nucleotide sequence analysis of the cloned fragment showed a partial ORF (without the start codon) encoding the 3’ portion of the NIb protein (viral polymerase), and the coat protein (CP), followed by a 3' untranslated region (3'UTR). The CP and 3’ UTR nucleotide sequence shared low identity with other potyvirus sequences in public databases. The highest nucleotide identity was 63 % with Araujia mosaic virus (ArjMV), while the highest amino acid identity (60 %) with Narcissus late season yellows virus (NLSYV). The phylogenetic analysis confirmed the clustering of C17 isolate with NLSYV and suggested that they may have evolved from a common ancestral. According to the species demarcation criterion for Potyvirus species (82% and 76% identity of CP amino acid and nucleotide sequence, respectively), C17 isolate can be considered as a novel virus belonging to the Potyvirus genus. The name Arracacha mottle virus is proposed. In order to develop a detection tool more sensitive than serology, specific primers were designed and evaluated for the use in RT-PCR. One primer pair showed excellent specificity and sensitivity results and is recommended for application in detection tests when high sensitivity is needed. The sequence of the 3' terminal end of this virus was quite different from other potyviruses, hence complete genome cloning was attempted. The strategy used was based on RT-PCR with primers designed towards conserved regions of the potyvirus genome. A total of ten partial clones were obtained, which corresponded to 90% of the viral genome. Inserts of these clones are being sequenced by primer walking. To date, 70% of the nucleotide sequence has already been determined. This is the first report of the identification and characterization of a virus infecting arracacha in Brazil.