Uso de ferramentas biotecnológicas para o controle de pragas agrícolas

Abstract

O Brasil é o quinto maior produtor de algodão do mundo, e também um dos maiores produtores mundiais de fibra, contribuindo positivamente para a balança comercial. O algodão é atacado por uma série de pragas, sendo o bicudo-doalgodoeiro, Anthonomus grandis, um dos insetos-pragas mais destrutivos. Além do bicudo-do-algodoeiro, o nematoide das galhas Meloidogyne incognita é uma praga importante desta e de outras culturas. O presente trabalho foi realizado visando o desenvolvimento de ferramentas biotecnológicas para o controle destas duas pragas agrícolas. No caso de A. grandis, a técnica do silenciamento gênico por RNAi foi utilizada para estudar a importância da Vitelogenina (proteína envolvida na reprodução dos insetos) para este inseto-praga. A técnica de RNAi é utilizada como ferramenta de validação funcional de genes e para o controle de pragas, e vem sendo utilizada na nova geração de plantas transgênicas. Isto em vista, no presente trabalho foram avaliados os efeitos do silenciamento gênico da vitelogenina de A. grandis (Agvtg) na biologia e no desenvolvimento do inseto adulto e da progênie. Inicialmente, foi realizado um estudo para identificar os melhores genes referência a serem utilizados em estudos gerais de qRT-PCR com este inseto. Após esta identificação, foi determinado o padrão de expressão do gene Agvtg e verificou-se a presença de transcritos em diferentes fases do desenvolvimento do inseto através de qRT-PCR. A proteína (AgVtg) foi localizada, por imunocitoquímica, em oócitos em desenvolvimento. Após microinjeção de dsRNA para Agvtg (dsVtg) em fêmeas de A. grandis, foi verificada uma significativa diminuição no acúmulo de transcritos deste gene. Além disto, verificou-se que as fêmeas tratadas com o dsVtg são capazes de produzir ovos na mesma quantidade dos tratamentos controle, porém, a maior parte dos ovos era inviável. Estudos realizados por meio de microscopia dos ovos oriundos de fêmeas tratadas com dsVtg revelaram, ainda, diferentes fenótipos, correspondentes a paralização do desenvolvimento do embrião em diferentes estágios de desenvolvimento, indicando, provavelmente, diferentes níveis desilenciamento gênico. Os estudos realizados com M. incognita, por sua vez, foram feitos utilizando uma estratégia distinta da anterior. Sabe-se que o nematoide das galhas estimula o ciclo celular das células hospedeiras das plantas, assim, foram utilizadas linhagens de plantas de Arabidopsis thaliana superexpressando proteínas inibidoras do ciclo celular de plantas (KRPs) e mutantes que não expressam estas proteínas para avaliar o efeito no ciclo de vida do patógeno. Esse trabalho nos permitiu demonstrar a possível função de KRP3, KRP5 e KRP7 em galhas induzidas por nematoides. Nossos resultados demonstram que todos os membros desta família afetam a progressão do ciclo celular durante a formação de galhas de forma diferente, afetando o ciclo de vida do nematoide. Assim, os dados gerados neste trabalho certamente contribuirão consideravelmente para o desenvolvimento de novas técnicas e ferramentas para o controle da principal praga do algodão no país, o bicudo-do-algodoeiro, e do nematoide de galhas, Meloidogyne incognita. ____________________________________________________________________________________ ABSTRACT

Brazil is ranked as the fifth world cotton producer, being also one of the largest fiber producers in the world, leading in high contribution to the commercial trade. Cotton is produced in monoculture system, and it is attacked by a large number of pests. The cotton boll weevil, Anthonomus grandis, is one of the most destructive pests of cotton. Also, the root-knot nematode Meloidogyne incognita is an important pest that infect many plants species including cotton. The present work was conducted to develop biotechnological tools for the control of these two agricultural pests. In the case of A. grandis, the technique of gene silencing by RNAi was used to study the importance of vitellogenin (protein involved in reproduction) for this insect pest. The RNAi technique is used as a tool for validation of gene function and pest control, and is used in the new generation of transgenic plants. The present study evaluated the effects of gene silencing of vitellogenin in A. grandis (Agvtg) in biology,development of the adult insect and its progeny. Initially, a study was conducted to identify the best reference genes to be used in general studies qRT-PCR with this insect. After, it was determined the expression pattern of Agvtg gene and the presence of transcripts at different stages of insect development was verified by qRT-PCR. The protein (AgVtg) was located by immunocytochemistry in developing oocytes. After microinjection of dsRNA for Agvtg (dsVtg) in A. grandis females, there was a significant decrease in transcripts accumulation of this gene. Furthermore, it was found that females treated with dsVtg are able to produce eggs in the same amount of control treatments, however, most of the eggs was not viable. Studies performed by microscopy of the eggs that came from females treated with dsVtg also revealed different phenotypes, corresponding to paralysis of embryo development in different stages of development, probably indicating different levels of gene silencing. Studies realized with M. incognita, were made using a different strategy from above. It is known that the root-knot nematode stimulates the cell cycle of the host cells in plants. So Arabidopsis thaliana lines overexpressing cell cycle inhibitory proteins from plants (KRPs) and also mutants which do not express these proteins were used to evaluate the effect the pathogen life cycle. This work allowed us to demonstrate the possible role of KRP3, KRP5 and KRP7 in galls induced by nematodes. Our results demonstrate that all members of this family affect cell cycle progression during gall formation differently, thus affecting the nematode life cycle. Thus, the data generated in this study will certainly contribute significantly to the development of new techniques and tools for the control of major cotton pest in the country, cotton boll weevil, and the root-knot nematode, Meloidogyne incognita.