Estratégias para a embriogênese somática e conservação ex situ de germoplasma de macaúba [Acrocomia aculeata (Jacq.) Lodd. ex Mart.]

Abstract

O presente trabalho objetivou estabelecer estratégias para a clonagem por embriogênese somática e conservação ex situ de macaúba (Acrocomia aculeata). Para a embriogênese somática a partir de embriões zigóticos (EZ), foram avaliados o efeito das auxinas 2,4-D, dicamba e picloram nas concentrações de 0, 1,5 e 3,0 mg L-1, assim como os meios de cultura de MS e Y3. Na diferenciação de embriões somáticos (ES) as concentrações das auxinas foram reduzidas para 0,5 e 1,0 mg L-1. A regeneração de plantas foi realizada em meio de cultura desprovido de auxina. A formação de calos embriogênicos (CE) foi observada em todas as auxinas e concentrações testadas e, entre os meios de cultura foi observado resultados significativos com o uso de meio Y3. ES foram observados após 60 dias em meio de diferenciação e a frequência de regeneração de plantas atingiu valores de até 31,9%. Na embriogênese somática a partir de segmentos foliares de plantas in vitro, EZ foram germinados em meio Y3 contendo 0 e 225 μM de 2,4-D (pré-tratamento). A parte aérea das plantas foi dividida e seccionada em quatro regiões: meristemática, basal, mediana e apical. Os segmentos de cada região foram inoculados em meio contendo 450 μM de picloram para a indução de calos. Neste experimento, a diferenciação de ES ocorreu em meio com 40 e 80 μM de picloram. O uso do pré-tratamento de indução aumentou a capacidade de formação de CE e de ES. A região meristemática foi a que apresentou os melhores resultados. Em ambos os meios de diferenciação observou-se ES formados. Para aquisição da competência para formação de calos a partir de folhas e ovários imaturos de plantas adultas, foram avaliados o efeito das auxinas 2,4-D, dicamba e picloram, os meios de cultura de MS e Y3, as regiões basal e apical do palmito, quatro tipos de explantes provenientes de ovários imaturos e três classes quanto ao estádio de desenvolvimento das inflorescências. A auxina picloram associada à concentração de 450 μM proporcionou resultados superiores na indução de CE, em ambos os explantes testados. O meio Y3 aumentou a formação de calos em explantes foliares, porém, não teve influência nos explantes provenientes de flores femininas. Para a conservação de germoplasma de macaúba a médio-longo prazo, as sementes foram avaliadas quanto a tolerância à dessecação por até 168 horas. Após a determinação da melhor umidade para o armazenamento (5% de umidade), as sementes foram armazenadas a -196, -20, 6 e 25 °C por períodos de 0, 90, 180 e 360 dias. Para avaliar a viabilidade e germinação após cada período de armazenamento, as sementes foram desinfestadas e os EZ excisados e cultivados in vitro. Os resultados indicaram que as sementes de macaúba podem ser dessecadas para valores de até 4,3% de umidade, sem perda da viabilidade e com germinabilidade superior a 90%. As sementes armazenadas apresentaram perda da viabilidade ao longo dos períodos de avaliação em todas as temperaturas de conservação testadas, indicando que a categoria subortodoxa seja mais adequada para classificar as sementes desta espécie. No experimento de criopreservação de embriões zigóticos, esses foram extraídos de sementes e reidratados por 15 h em meio contendo 3% de sacarose. Em seguida, os EZ foram submetidos a dessecação por até 8 horas. Para cada período, parte dos embriões foi inoculada em meio de germinação e parte foi colocada em criotubos estéreis e imersos diretamente em nitrogênio líquido por até 360 dias. Após os período de armazenamento, foi realizado o descongelamento rápido dos criotubos em banho-maria a 40 °C por 90 segundos. Os resultados revelaram que há diminuição da germinabilidade com o aumento do tempo de dessecação dos EZ, com médias de 97 e 75% para 0 horas e 8 horas de dessecação, respectivamente. Para os embriões zigóticos criopreservados, a maior percentagem de germinação (81%) foi obtida após 6 horas de dessecação, quando os embriões apresentavam 11% de umidade. O presente trabalho contribui com informações relevantes tanto para a propagação vegetativa quanto para a conservação dessa espécie. Verificou-se que a embriogênese somática pode ser obtida a partir de diferentes fontes de explantes e a criopreservação pode representar uma nova estratégia para a conservação de germoplasma de macaúba por longos períodos. ______________________________________________________________________________________________ ABSTRACT

This study aimed to establish strategies for cloning by somatic embryogenesis from different explants and evaluate the desiccation tolerance and medium to long term storage of seeds and zygotic embryos of macaw palm (Acrocomia aculeata) for ex situ conservation. For the somatic embryogenesis from zygotic embryos (ZE) the effect of the auxin 2,4-D, dicamba and picloram at concentrations of 0, 1.5, and 3.0 mg L -1 and culture media MS and Y3, were evaluated. For the differentiation of somatic embryos (SE), the concentrations of auxin was reduced to 0.5 and 1.0 mg L- 1. Plant regeneration was performed in culture medium without auxin. The formation of embryogenic calli (EC) was higher in Y3 medium. SE were observed after 60 days in differentiation medium. The frequency of plant regeneration reached values of up to 31.9%. In somatic embryogenesis from leaf segments of in vitro plants, the effect of using a pre-induction treatment on calli and somatic embryo formation and was evaluated and more responsive explants characterized. For this, ZE were germinated in Y3 containing 0 and 225 μM of 2,4-D (pre-treatment). The aerial part of the plant was sectioned into four regions: meristematic, basal, median and apical. The segments from each region were inoculated in medium containing 450 μM of picloram for calli induction. The differentiation of SE occurred in medium with 40 and 80 μM of picloram. The use of the pretreatment increased the ability to induce the formation of EC as well as SE. The meristematic region showed superior results in the induction of EC and SE compared to the other regions tested. In both differentiation media we observed differentiated SE. In the acquisition of competence for calli formation from young imature and ovaries, we evaluated the effect of auxins 2,4-D, dicamba and picloram, the culture media MS and Y3, the basal and apical foliar regions of the palmetto tree, four types of explants from ovaries and three inflorescence development stage classes. The auxin, picloram associated with concentration of 450 μM, showed superior results in the induction of EC in both explants tested. The Y3 medium increased calli formation in leaf explants, however, it did not influence explantes from ovaries. For the conservation of macaw palm seed germplasm over the medium to long term, the seeds were evaluated for tolerance to desiccation for up to 168 hours. After determining the best moisture content for storage (5% moisture), seeds were stored at -196, -20, 6, and 25° C for 0, 90, 180 and 360 days. To assess the viability and germination after each storage period, the seeds were desinfested and ZE excised and cultivated in vitro. The results indicated that the macaw palm seeds can be desiccated to up to 4.3% moisture, without loss of viability and with a germination rate above 90%. Seeds stored for 360 days showed loss of viability over the evaluation periods at all storage temperatures tested, indicating that the suborthodox category is more appropriate to classify the seeds of this species. Based on the seed conservation results obtained, cryopreservation of zygotic embryos presents a viable alternative for the germplasm conservation of this species. For this experiment, ZE were extracted from seeds and rehydrated for 15 h in medium containing 3% sucrose. The ZE were then subjected to drying in a laminar flow chamber 0, 2, 4, 6 and 8 hours. For each period, a portion of the embryos was inoculated in germination medium and a portion was placed in sterile vials and immersed directly into liquid nitrogen for up to 360 days. After each storage period, rapid thawing of the cryotubes was conducted in a water bath at 40° C for 90s. The desiccation results showed that germinability decreases with increased drying time, averaging 97 and 75% for 0 hours and 8 hours of desiccation, respectively. For cryopreserved zygotic embryos, the highest germination percentage (81%) was obtained after 6 hours of desiccation, when the embryos had 11 % moisture. Embryos cryopreserved with 11% moisture content for up to 360 days showed 75% survival. This study contributes information relevant to both vegetative propagation and for the conservation of genetic resources of this species. Somatic embryogenesis can be obtained from different explant sources, and cryopreservation of zygotic embryos may represent a new strategy for the conservation of macaw palm germplasm for long periods.