Avaliação da via fosfatidilinositol 3-cinase em células do cumulus provenientes de ovócitos maturados in vitro em meio definido

Abstract

Introdução: A maturação do complexo cumulus-ovócito (CCO) in vitro depende do meio de cultivo no qual se encontra e é uma biotécnica bastante difundida para a geração de embriões bovinos para a produção de gado. A biologia do desenvolvimento do ovócito tem como indicadores a maturação nuclear, esteroidogênese, apoptose e nutrição dos CCOs, tendo as células do cumulus papel central nesses aspectos. A via fosfatidilinositol 3-cinase (PI3-K) tem ações comprovadas nos parâmetros citados, tornando-a ponto relevante no estudo da biologia dos CCOs bovinos. O presente trabalho visa estudar esses parâmetros para esclarecer algumas funções biológicas do meio definido e patenteado MIV B e da adição de 10 ng/mL de FSH. Para inferir a importância da PI3-K foi utilizado o inibidor dessa via (LY294002) durante o cultivo de CCOs. Métodos: Ovário bovinos foram coletados em abatedouros e os CCOs aspirados para cultivo por 22–24 horas. Os seguintes meios-teste foram utilizados, tendo o meio MIV B como base: 0FSH; 0FSH 10LY (+10 μM LY294002); 0FSH 100LY (+100 μM LY294002); 10FSH; 10FSH 10LY ou 10FSH 100LY. Posteriormente, a dose de 10 μM foi excluída, pois não apresentou nenhum efeito. A androstenediona foi suplementada para sustentar a esteroidogênese. Após o cultivo, os CCOs foram desnudos e as células do cumulus isoladas para as aferições subsequentes. Foram avaliadas a retomada e progressão da maturação nuclear, a expulsão do corpúsculo polar e a produção de hormônios 17 beta-estradiol (E2) e progesterona (P4). As células do cumulus foram analisadas para determinar a expressão de genes, por PCR real time, referentes à esteroidogênese (LHR, FSHR, CYP11A1, CYP19A1 e HSD17B1), apoptose (Bax), sobrevida celular (Bcl-2) e nutrição do CCO (GLUT1, GLUT4, PDH, G6PDH e SNAP25). Resultados: No meio 0FSH foi encontrado imaturidade nuclear e baixa taxa de expulsão do corpúsculo polar. Porém, manteve a produção de E2 e P4 e a expressão dos receptores de FSH e LH e das enzimas da esteroidogênese, mimetizando a condição de folículo ovariano em crescimento. O meio 0FSH ainda apresenta baixa expressão de Bax, Bcl-2 e GLUT1 e aumento da expressão de G6PDH e SNAP25. A adição do inibidor (meio 0FSH 100LY) causou a progressão da meiose, inibição da expulsão do corpúsculo polar, diminuição de E2 e aumento de P4. O meio inibiu a expressão de LHR, FSHR, CYP11A1, CYP19A1 e HSD17B1. Também houve diminuição da expressão de GLUT4 e G6PDH. No meio 10FSH há retomada e progressão da meiose e expulsão do corpúsculo polar, manutenção da produção de E2 e P4. Houve baixa expressão de LHR, FSHR, CYP19A1 e HSD17B1. Além disso, houve aumento da expressão de GLUT1, G6PDH, Bcl-2 e Bax e baixa expressão de GLUT4 e SNAP25, em relação ao meio 0FSH. A suplementação do inibidor (meio 10FSH 100LY) causou inibição da expulsão do corpúsculo polar e diminuição de E2. Houve aumento da expressão de LHR e CYP19A1, além da diminuição da G6PDH e Bax. O gene PDH não sofreu modificação em nenhum dos tratamentos. SNAP25, GLUT1 e Bcl-2 não foram afetadas pelo LY294002. Conclusões: O meio MIVB 0FSH é capaz de manter a esteroidogênese e a nutrição do CCOs, baseando-se na expressão gênica. A adição de FSH causa diminuição da expressão de genes importantes da esteroidogênese, mas aumenta os de sobrevida e de metabolismo (GLUT1 e G6PDH). Além disso, a via PI3-K tem ações diferentes no meio com e sem FSH. No meio sem FSH, a via mantém a expressão dos genes esteroidogênese e metabolismo (GLUT4 e G6PDH). No meio com FSH, inibe LHR e CYP19A1 e mantém G6PDH e Bax. ________________________________________________________________________________ ABSTRACT

Introduction: The maturation of cumulus oocyte complex (COC) in vitro depends on culture medium environment and it is a widely used biotechnology to produce bovine embryos for livestock production. The developmental biology of oocyte involves nuclear maturation, steroidogenesis, apoptosis and nutrition of COC, with central role of cumulus cells. The phosphatidylinositol 3-kinase (PI3-K) pathway controls the parameters cited previously, making PI3-K pathway relevant for the COC biology. The aim of the present work was to study those parameters to elucidate biology functions of a defined medium MIV B (patent medium of the lab) and the addition of 10 ng/mL of FSH. To infer the PI3-K role, its inhibitor (LY294002) was used in COC culture. Methods: Bovine ovaries were obtained at abattoirs and COC were aspirated for 22– 24 hours of culture. The CCOs were allocated in the following experimental groups, using the MIV B: 0FSH; 0FSH 10LY (+10 μM LY294002); 0FSH 100LY (+100 μM LY294002); 10FSH; 10FSH 10LY or 10FSH 100LY. After preliminary results the 10 μM of LY294002 were excluded because did not show effect. Androstenedione was supplemented to sustain steroidogenesis. After culture, COC were denuded and cumulus cells were isolated to subsequent evaluations. Resumption and progression of nuclear maturation, polar body extrusion, and steroid hormones final concentration 17 beta-estradiol (E2) and progesterone (P4) were evaluated. The cumulus cells were analyzed to determine gene expression, for PCR real time, of proteins involved in steroidogenesis (LHR, FSHR, CYP11A1, CYP19A1 and HSD17B1), apoptosis (Bax), cell survival (Bcl-2), and nutrition of CCO (GLUT1, GLUT4, PDH, G6PDH and SNAP25). Results: MIV B 0FSH leads to immature nuclear status and low rates of polar body extrusion. However, the medium maintained the E2 and P4 values in culture media and expression of receptor of FSH and LH and of steroidogenic enzymes, mimetizing a growing ovarian follicle. 0FSH group presented low expression of Bax, Bcl-2 and GLUT1 and high levels of G6PDH and SNAP25. The addition of inhibitor (0FSH 100LY group) caused the meiosis progression, inhibition of polar body extrusion, decrease of E2 and enhance of P4 levels. The medium also decreased the LHR, FSHR, CYP11A1, CYP19A1 and HSD17B1 gene expression. GLUT4 and G6PDH expression were also inhibited by the medium. In the 10FSH medium the levels of resumption and progression of meiosis and polar body extrusion were higher, and E2 and P4 levels were maintained. LHR, FSHR, CYP19A1 and HSD17B1 expression were inhibited. In addition, the expression of GLUT1, G6PDH, Bcl-2 and Bax were stimulated and GLUT4 and SNAP25 were inhibited in comparison to 0FSH. The supplementation of inhibitor (10FSH 100LY group) prevented polar body extrusion and decreased E2 values. There was an increase of LHR and CYP19A1, and decrease of G6PDH and Bax expression. PDH gene expression did not change after culture treatments. SNAP25, GLUT1 and Bcl-2 expression were not affected by the LY294002. Conclusion: In conclusion, the MIV B 0FSH was able to maintain steroidogenesis and the nutrition of COC, based on gene expression. The addition of FSH caused a diminishing of gene expression of steroidogenesis, however improves those related to cell survival and metabolism (GLUT1 and G6PDH). Furthermore, PI3-K pathway demonstrates different action in the medium with and without FSH. The medium without FSH, the pathway maintains steroidogenesis and metabolism (GLUT4 and G6PDH). The medium with FSH inhibits LHR and CYP19A1 and maintains G6PDH and Bax.