Metabolismo de radicais livres durante a diapausa da lagarta do girassol (Chlosyne lacinia)

Abstract

Em diferentes processos de depressão metabólica animal (e.g. hibernação, estivação e diapausa), o sistema antioxidante endógeno exerce relevante papel, sendo um importante componente da maquinaria de adaptação fisiológica. Dentre as situações de depressão metabólica nas quais o metabolismo redox foi estudado, a diapausa destaca-se por ter sido pouco estudada, e menos ainda se conhece sobre o papel de antioxidantes na diapausa de insetos tropicais. O objetivo deste estudo foi identificar adaptações do metabolismo redox associadas à diapausa tropical, utilizando como modelo lagartas do girassol Chlosyne lacinia. Neste estudo, foram determinadas as atividades de enzimas do metabolismo intermediário e do sistema antioxidante, além das concentrações de glutationa e de indicadores de estresse oxidativo em homogeneizados de corpo inteiro. Foram analisados animais coletados em três períodos, janeiro e março de 2010 e junho de 2011. Os grupos experimentais foram animais ativos (controle), animais em diapausa por menos de 24 horas, 20, 40, 60 e 120 dias, e animais ativos por 48-72h após 120 dias de diapausa. A atividade de citrato sintase (CS) diminuiu 70% no início da diapausa, sendo restabelecida no final da diapausa. As atividades das enzimas antioxidantes ascorbato peroxidase, glutationa peroxidase e catalase seguiram o mesmo padrão, diminuindo 64%, 51% e 43% respectivamente no inicio da diapausa e retornando aos valores de animais ativos no final da diapausa. As atividades de glicose 6-fosfato desidrogenase e piruvato quinase permaneceram inalteradas. No inicio da diapausa, houve um aumento abrupto (360%) da atividade de isocitrato desidrogenase dependente de NADP+ (ICDH), cuja atividade permaneceu elevada até o quadragésimo dia de diapausa. A atividade de glutationa transferase (GST) aumentou em resposta à diapausa, nas primeiras 24 horas de diapausa de animais amostrados em 2011 (370%). Em janeiro e março de 2010, o aumento da atividade de GST foi influenciado por variações na atividade dos grupos controles. As concentrações de equivalentes de glutationa (GSH-eq), glutationa reduzida (GSH) e de glutationa dissulfeto (GSSG) diminuíram significativamente durante a diapausa e retornaram aos níveis do controle após a diapausa. A razão GSSG/GSH-eq permaneceu inalterada. As concentrações de TBARS e proteínas carboniladas foram reduzidas ou permaneceram inalteradas durante a diapausa. A diminuição da atividade de CS sugere redução do metabolismo aeróbico, também observada em diferentes casos de diapausa. Uma menor potencial de produção de espécies reativas de oxigênio em conjunto com os mecanismos de economia energética durante a diapausa podem explicar a diminuição dos níveis de antioxidantes endógenos. O início da diapausa é marcado por um elevado potencial de produção de NADPH, que pode ser empregado no sistema antioxidante, na síntese de ácidos graxos e na síntese de polióis – servindo como um mecanismo de proteção à desidratação. A elevada atividade de GST, observada também em outros insetos em diapausa, pode exercer funções além da destoxificação de xenobióticos, incluindo a ligação e transporte de biomoléculas. A ausência de evidencias de aumento de estresse oxidativo e de desequilíbrio redox indica que C. lacinia apresenta adaptações bioquímicas eficientes para sobreviver às transições metabólicas de entrada e saída da diapausa. ___________________________________________________________________________________________ ABSTRACT

Animals challenged with adverse environmental conditions rely on metabolic depression is as an important adaptive response. Endogenous antioxidant defenses play important roles in different metabolic depression processes (e.g. hypoxia tolerance, freezing, hibernation, estivation and diapause). Among the situations of metabolic depression in which the redox metabolism have been addressed, diapause is one of the least studied, especially in tropical insects. The aim of this work was to identify adaptations of the redox metabolism associated to tropical diapause employing as an animal model the bordered patch Chlosyne lacinia caterpillars. The determination of antioxidant and intermediary metabolism enzymes activity and of glutathione and oxidative stress markers concentrations were conducted in whole body homogenates. Animals were collected in three different months, January and March (2010), and June (2011). Experimental groups were active animals (control), diapausing animals for 0-24 hours, 20, 40, 60 and 120 days, and post-diapause active animals. Citrate synthase (CS) activity decreased (70%) at the diapause beginning and returned to control levels at the end of diapause. The activities of the antioxidant enzymes ascorbato peroxidase, catalase and glutathione peroxidase (selenium independent) also decreased by 64%, 51% and 43% respectively at the diapause beginning and returned to control levels at the end of diapause. The activities of glutathione reductase and selenium dependent glutathione peroxidase were not detected in C. lacinia. There were significant correlations between antioxidant activities and CS activity. Glucose 6-phosphate dehydrogenase and pyruvate kinase activity remained unchanged is response to diapause. Isocitrate dehydrogenase (NADP+) activity increased at diapause beginning and remained higher than control until the 40th day of diapause. Glutathione transferase (GST) activity increased in response to diapause. In the first 24 hours of diapause GST activity increased by 370%. The concentrations of glutathione equivalents (GSH-eq), reduced glutathione (GSH) and oxidized glutathione (GSSG) decreased significantly during diapause and returned to control levels after diapause. Thus, the GSSG/GSH-eq ratio was unaltered. The levels of oxidative stress markers (TBARS and protein carbonyls) either decreased or remained constant during diapause. The results indicate decreased mitochondrial density and reduced aerobic metabolism those were already related during diapause in other species. Potentially diminished production of reactive oxygen species together with mechanisms of reduced energetic demand justify the reduction of endogenous antioxidants. Diapause beginning is accompanied by an increased potential production of NADPH, which could be used by the antioxidant system, by fatty acid synthesis and by polyol synthesis – as dehydration resistance mechanism. Increased GST activity, also observed in other diapausing insects, could play roles other than xenobiotics detoxication, including the binding and transport of biomolecules. The biological function of GST during diapause must be further investigated. The lack of evidences showing oxidative stress or redox imbalance indicates that C. lacinia presents efficient biochemical adaptation to survive the metabolic transitions occurring in the tropical diapause under low humidity.