Análise proteômica comparativa entre neutrófilos quiescentes e estimulados com fator de agregação plaquetária (PAF)

Abstract

Os neutrófilos huμanos são celulas já diferenciadas do sangue periférico, constituindo 40−70% dos leucócitos na circulação em condições normais. É o o primeiro tipo celular a atingir o local da infecção. Eles possuem 3 fenótipos diferentes: quiescente, estimulado e ativado. Várias moléculas pró−inflamatórias podem causar estimulação e ativação dos neutrófilos, incluíndo o mediador lipídico pró−inflamatório PAF. O PAF tem potentes efeitos diretos sobre o neutrófilo e pode induzir quimiotaxia, polimerização de actina, produção de ROS em pouca quantidade e agregação, além de outras ações de estimulação. Nesse estudo, os neutrófilos foram purificados a partir do sangue venoso periférico de voluntários sadios, obtidos após centrifugação do sangue total pelo gradiente de percoll (pureza > 97% e viabilidade > 98%). 107 células foram estimuladas com 20 nM de PAF por 30 minutos. As análises citométricas mensuraram a explosão respiratória, viabilidade e pureza dos neutrófilos. Foram preparados géis bidimensionais de extratos de neutrófilos quiescentes e estimulados por PAF, comparados seus mapas proteômicos e identificadas proteínas por PMF e MS/MS. A análise comparativa dos géis 2D entre as condições revelou 108 spots com expressão diferencial, sendo que 66 spots representam um aumento na expressão protéica após estimulação pelo PAF e 42 representam diminuição (p•0,05). Além disso, 114 spots foram considerados como pertencentes apenas ao mapa do gel quiescente e 129 spots exclusivos do mapa neutrofílicos estimulados por PAF. Forμa identificados 50 proteínas, sendo 3 coμ auμento de expressão após estiμulação, 2 coμ diμinuição de expressão, 1 exclusiva da condição quiescente e 42 sem expressão diferencial. Proteínas coμ aumento de expressão foraμ: vimentina, filamento interμediário, uμ coμponente do citoesqueleto; tubulina beta, uμa proteína presente nos μicrotúbulos, também considerada uμ componente do citoesqueleto e SNAP− , uma proteína envolvida no processo de fusão dos grânulos à μeμbrana plasμática. Proteínas que diμinuíraμ a expressão: subunidade 5 da Arp 2/3, proteína que muda a direção da polimerização da actina e proteína S10A9−humana com possível função quimiotática. Proteína exclusiva: anexina A5 inibe a ação da fosfolipase A2. O presente estudo representa uma importante etapa para se coμpreender as vias de estimulação dos neutrófilos durante o processo inflamatório. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT

Human neutrophils are differentiated cells in peripheral blood, which constitute 40 70% of circulating white blood cells, counted under normal conditions. Neutrophils are the first cells recruited froμ the bloodstream to sites of infection. These cells exhibit three different phenotypes: quiescent, priμed and activated. Several proinflammatory molecules can induce the primed and activated state, including the PAF. The PAF, a proinflammatory lipid mediator, has potent direct effects on eutrophils and can induce chemotaxis, actin polymerization, production of small amount of ROS and aggregation, and other priming−type actions. In this study, human neutrophils were prepared from peripheral venous blood of healthy volunteers (> 97% purity, > 98% viability) and were obtained by density centrifugation on Percoll gradient. 107 cells were stimulated with 20 nM PAF for 30 minutes. Cytometric analysis was executed for measurement of respiratory burst, viability and purity of neutrophils. Quiescent and PAF stimulated neutrophils were submitted to two−dimensional electrophoresis to, compare their proteomic map and to identify proteins by PMF and MS/MS. The comparison between the two conditions revealed 108 spots differentially expressed, among which 66 spots were upregulated after PAF stimulation and 42 were downregulated in this condition (p•0,05). Moreover, 114 spots were regarded as belonging only to quiescent gels, and 129 spots were exclusive of the PAF stimulated neutrophil map. We identified 50 proteins, 3 with increased expression after stiμulation, 2 with decreased expression, 1 exclusive of the quiescent condition and 42 without differential expression. Proteins with increased expression were: vimentin, the intermediate filament, classified as a coμponent of the cytoskeleton; tubulin beta, present in μicrotubules, also a component of the cytoskeleton; and SNAP− , involved in the fusion of granules to the plasma membrane. Proteins that decreased expression: complex Arp2/3 subunit 5, a protein that changes the direction of polymerization of the actin and S10A9−Human, a protein with a possible chemotactic function. Protein exclusive: annexin A5, that inhibits the action of phospholipase A2. This study presents a further step towards the understanding of stiμulation pathways in neutrophils during an inflammatory process.