Identificação, purificação e caracterização de peptídeos antimicrobianos presentes na secreção cutânea do anuro Hypsiboas raniceps

Abstract

O estudo de novas fontes de compostos bioativos permitiu o desenvolvimento de muitos produtos biotecnológicos, incluindo drogas com importantes atividades biológicas, muitas das quais são usadas atualmente no tratamento de doenças relevantes, especialmente de natureza infecciosa. No presente trabalho, foi realizada uma varredura por peptídeos com atividade antifúngica a partir da secreção cutânea da rã brasileira Hypsiboas raniceps. Indivíduos adultos de H. raniceps foram coletados no estado de Goiás, Brasil. As secreções cutâneas foram obtidas por meio de estimulação elétrica moderada, congeladas, secas e fracionadas por HPLC empregando-se coluna de fase reversa C18. Todas as frações cromatográficas foram testadas quanto à capacidade de inibir a proliferação do fungo Candida albicans e as frações ativas foram analisadas por espectrometria de massas (MALDI-TOF MS). O perfil cromatográfico resultou em cerca de 30 frações, oito das quais promoveram redução na proliferação do fungo C. albicans acima de 25%. As frações com atividade antifúngica apresentaram componentes de massa molecular variando entre 1000 e 3000 Da. As frações 27 e 28 foram as mais ativas, mas a análise por MS revelou a presença de vários componentes nessas frações. A fração 28 foi selecionada e submetida a uma passo cromatográfico adicional, levando à obtenção do peptídeo bioativo presente nessa fração. O peptídeo HR 36 puro foi acumulado e testado contra o fungo C. albicans. Este novo peptídeo apresenta massa molecular igual a 3 kDa e é capaz de inibir a proliferação de C. albicans na concentração de 128 M em 50%. No presente estudo, foi constatada que a secreção cutânea de H. raniceps é uma fonte de peptídeos antifúngicos e um novo peptídeo antifúngico de 3 kDa foi obtido em alto grau de pureza de modo a permitir a sua caracterização biológica e química. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT

The study of new sources of bioactive compounds allowed the development of many biotechnological products, including drugs with important biological activities, many of which are used today for the treatment of relevant diseases, especially those of infectious nature. In the present study we performed a screening for peptides with antifungal activity from the skin secretion of the Brazilian frog Hypsiboas raniceps. Adult specimens of H. raniceps were collected in Goiás, Brazil. Skin secretions were obtained by mild electric stimulation, freeze-dried and fractionated by HPLC using a C18 reversed-phase column. All fractions were tested for inhibitory activity against the fungus Candida albicans, and the bioactive fractions were submitted to mass spectrometric analysis (MALDI-TOF MS). The typical chromatographic profile showed approximately 30 fractions, eight of which promoted reduction in yeast cell proliferation above 25%. The antifungal fractions showed molecular mass components ranging from 1000 to 3000 Da. Fractions 27 and 28 were the most active but the MS analysis revealed multiple components present in these fractions. Fraction 28 was selected and submitted to an additional chromatographic step in order to obtain the major bioactive peptide present in this sample. Peptide HR 36 was acumulated and tested against C. albicans. This new peptide has a molecular mass of 3 kDa and is able to inhibit the proliferation of C. albicans at 128 M in 50%. It was observed that H. raniceps skin secretion is a source of antifungal peptides and one new 3 kDa antifungal peptide was obtained in high-purity which will allow in its biological and chemical characterization.