Estudo da atividade dos extratos de plantas e fungos endofíticos isolados do cerrado brasileiro em linhagem celular de feocromocitoma

Abstract

Introdução: Feocromocitomas são tumores altamente vascularizados derivados da medula adrenal. A maioria dos casos é benigna, mas formas malignas já foram descritas. A ressecção cirúrgica é a única forma definitiva de cura para tumores benignos, enquanto tumores malignos ainda não possuem tratamento eficaz. Os sintomas da forma maligna usualmente são tratados com quimioterapia e bloqueadores adrenérgicos, mas vários outros alvos terapêuticos estão sendo estudados recentemente. Grande parte dos medicamentos quimioterápicos comercializados é obtida por semissíntese de componentes químicos de plantas e fungos, e a biodiversidade brasileira pode auxiliar no desenvolvimento de novas drogas para esta patologia. Objetivo: Investigar a atividade antitumoral de extratos de plantas e fungos do Cerrado em linhagem celular de feocromocitoma. Métodos: A PC-12 Adh foi adquirida do BCRJ (Banco de Células do Rio de Janeiro), e cultivada em meio HAM-F12 suplementado com soro de cavalo, soro fetal bovino, bicarbonato de sódio, 10% de penicilina/estreptomicina, encubada a 37°C e 5% de CO2. Para os experimentos, as células foram plaqueadas na densidade de 5 x103 células por poço em placas de 96 poços, em triplicata. Após 24 horas de incubação, o ensaio de citotoxicidade foi realizado com avaliação de 24 e 48 horas de tratamento com concentrações de 500 e 1000 μg/mL das frações dos extratos (aquosa, etanólica e hexânica) dos 65 extratos obtidos de plantas e fungos do Cerrado diluídos em meio de cultura. Os extratos que demonstraram atividade citotóxica foram submetidos ao ensaio de curva dose-resposta em concentrações entre 125 e 2000 μg/mL. Após os tratamentos, a viabilidade celular foi mensurada utilizando o método colorímetro MTT (brometo de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,3-difeniltetrazólio). Os experimentos foram realizados em três análises independentes e a atividade citotóxica foi comparada na linhagem celular não tumoral de queratinócitos HaCat. Os dados foram analisados no GraphPad Prism 5® pelos testes estatísticos one-way ANOVA com teste pós-hoc de Tukey para os ensaios de citotoxicidade, e regressão não-linear e determinação do IC50 para os ensaios de dose-resposta. Os extratos que apresentaram atividade citotóxica similar ou inferior na linhagem celular não tumoral foram submetidos aos ensaios de flavonoides, polifenóis totais e cromatografia de camada delgada para determinar e quantificar os compostos químicos. Resultados: Os extratos etanólicos da folha e do fruto da Allamanda blanchetti ADC, e o extrato hexânico da folha e sua fração hexano:acetato de Etila do Erytroxylum subrotundum demonstraram atividade inibitória da viabilidade celular ≥ 50%, efeito dose dependente, e toxicidade similar ou inferior em HaCat. Os extratos de Allamanda blanchetti ADC e os extratos do Erytroxylum subrotundum apresentaram flavonoides e terpenos, respectivamente. Conclusão: Nesta triagem biológica do Bioma Cerrado, 04 dos 65 extratos de plantas e fungos demonstraram capacidade de controlar a proliferação celular do Feocromocitoma in vitro. Esses achados sugerem que os compostos químicos ativos encontrados possuem atividade citotóxica, corroborando com estudos de bioprospecção para o desenvolvimento de drogas antitumorais. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT

Introduction: Pheochromocytomas are highly vascularized tumors arising from adrenal medulla. The majority of cases are benign, but malignant forms have been described. Surgical resection is the only definitive healing for benign tumors, while malignant tumors still have no effective treatment. Symptoms from malignant disease are usually managed with cytotoxic chemotherapy and adrenergic blockers, but several new therapeutic targets have been studied recently. Most chemotherapy commercialized drugs are obtained by semi-synthesis from chemical compounds of plants and fungi, and Brazilian biodiversity could support on new drugs development for this pathology. Aim: investigate antitumoral activity of extracts from Cerrado plantas and fungi in pheochromocytoma cell line. Methods: The PC-12 Adh was purchased from BCRJ (Banco de Células do Rio de Janeiro), and maintained in HAM-F12 Medium supplemented with horse serum, fetal bovine serum, sodium bicarbonate, 10% penicillin/streptomycin stored at 37°C and 5% CO2. For the experiments, cells were seeded at a density of 5 x103 cell/well in 96-well plates, in triplicate. After 24h of incubation, cytotoxicity assay was performed after 24h and 48h of exposition to 500 and 1000μg/mL of each fraction (aqueous, ethanolic and hexanic) of 65 extracts obtained from Cerrado plants and fungi diluted in cell culture medium. The extracts that demonstrated cytotoxic activity were submitted to a dose response curve assay with concentrations varying from 125 to 2000μg/mL. After treatment, cell viability was measured using MTT (3-(4,5-dimethylthiazole-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide) colorimetric assay. Experiments were performed on three independent analysis and the cytotoxic activity were compared in non tumoral keratinocytes cell line Hacat. Data were analyzed on GraphPad Prism 5® by one-way ANOVA with Tukey pos-hoc test for cytotoxicity assays, and non-linear regression and IC50 determination. The extracts that presented similar or lower cytotoxic activity in non tumoral cell line were submitted to flavonoids, total polyphenols and thin layer chromatography to determine and quantify chemical compounds. Results: The ethanolics extracts of leaf and fruit from Allamanda blanchetti ADC, and hexanic extract and its Hexane:Ethyl Acetate of leaf from Erytroxylum subrotundum demonstrated a inhibitory activity of cell viability ≥ 50% on cytotoxicity assays, dose response effect, similar or lower cytotoxic activity on Hacat. The Allamanda blanchetti ADC extracts presented flavonoids and Erytroxylum subrotundum extracts terpenes. Conclusion: On this biological trial of Cerrado Biome, 04 of 65 plant and fungi extracts demonstrated the ability to control pheochromocytoma cell line proliferation. These findings suggest the presence of active chemical compounds with cytotoxic activity, corroborating bioprospecting studies for the development of new antitumoral drugs.