Análise transcritômica e proteômica da interação Musa acuminata x Mycosphaerella musicola

Abstract

A Sigatoka Amarela em banana (Musa spp.), causada pelo fungo Mycosphaerellamusicola, provoca desordem significativa de área foliar e amadurecimento prematuro do fruto. O desenvolvimento de genótipos resistentes a fungos patogênicos é de fundamental importância. A fim de desenvolver um recurso de genômica funcional para essa cultura oferencendo compreensão sobre os mecanismos moleculares das respostas de Musa a estresses bióticos, foi realizado um estudo de pirosequenciamento do transcritoma de Musa acuminata utilizando genótipos contrastantes em resistência ao patógeno M. musicola. Amostras de RNA total foram preparadas a partir do material foliar dos genótipos Calcutta 4 (resistente) e Cavendish Grande Naine (suscetível), ambos não infectados (controles não inoculados) e artificialmente desafiados com o patógeno. O estudo gerou 978.133 seqüências de alta qualidade, com um comprimento médio de 334pb e totalizando 466Mb, das quatro bibliotecas de cDNAseqüenciadas usando o 454 GS-FLX Titanium. A montagem de novo gerou 36.384 e 35.269 seqüênciasunigenes de M. acuminataCalcutta 4 e Cavendish Grande Naine, respectivamente. Seqüências montadas foram funcionalmente mapeadas nos termos do Gene Ontology (GO). As funções do unigenes cobriram uma ampla gama de funções moleculares, processos biológicos e componentes celulares. Os genes oriundos de uma série de vias relacionadas com a defesa foram observadas em transcritos a partir de cada biblioteca de cDNA.Inúmeros fatores de transcrição foram identificados, que são tipicamente envolvidos na regulação do desenvolvimento vegetal, sinalização e resposta ao meio ambiente, entre outros papéis. Muitos deles são também conhecidas por estarem envolvidas na transdução de sinal e regulação da expressão de genes responsivos ao estresse. Mais de 99% dos unigenes mapearam em regiões exônicas no genoma referência de M. acuminata DH Pahang. Além disso, a extração de proteínas foi realizada a partir dos materiais foliares inoculados e não inoculados. A focalização isoelétrica foi realizada utilizando o sistema IPGphor. A segunda dimensão foi realizada utilizando um gel de SDS-PAGE a 12%, com géis corados com solução de azul de Coomassie G-250. Os géis foram digitalizados usando um scanner ImageScanner II (GE Healthcare), e as imagem foram analisadas utilizando o software Imagem Master 2D Platinum 7.0 (GeneBio). Foramfeitastambémanálisesparadetecção de spotscomunsaomesmo cultivar (controle e tratado), bemcomo a identificação de spots com expressãodiferencial, e detecção de spotspresentes em apenasumacondição, denominados de spotsexclusivos. No cultivar resistente Calcutta 4, foramobservados 7 spotscomumaexpressãopelomenos 1,5 vezesmaior no tratadoquandocomparadoaocontrole. O padrão de expressãofoidiferente no cultivar suscetível, onde 1 spotapresentoudiferença de expressão entre o controle e o tratado. Os resultados da análise proteômica desta interação poderá gerar informações importantes, tais como: os tipos de proteínas expressas, as mudanças pós-tranducionais e respostas a diferentes condições ambientais, o que representa um elo entre a informação genotípica e fenotípica. Essa análise proteômica, em sobreposição com as informações transcritômicas geradas pelo seqüenciamentomassal com NGS, podem vir a beneficiar futuros programas de melhoramento genético de Musa na obtenção de genótipos resistentes. __________________________________________________________________________________________________ ABSTRACT

Sigatoka leaf spot disease in banana (Musa spp.), caused by Mycosphaerella mosicola, causes significant reduction in functional leaf area and premature ripening of fruit. The development of genotypes resistant to fungal pathogens is of paramount importance. In order to develop a functional genomics resource for this crop which offers insights into molecular mechanisms of responses in Musa to biotic stresses, we performed a pyrosequencing study of the transcriptome in Musa acuminata genotypes contrasting in resistance to the fungal pathogen M. musicola. Total RNA samples were prepared from whole plant leaf material from genotypes Calcutta 4 (resistant) and Cavendish Grande Naine (susceptible), both uninfected (non-inoculated controls) and artificially challenged with the pathogen. The study generated 846,762 high quality sequences reads, with an average length of 334pb and totaling 283MSb, from four full-length enriched cDNA libraries sequenced using a 454 GS-FLX system pyrosequencer with Titanium chemistry. De novo assembly generated 36,384 and 35,269 unigene sequences for M. acuminate Calcutta 4 and Cavendish Grande Naine respectively. Assembled sequences were functionally mapped to Gene Ontology (GO) terms. Unigene functions covered a diverse range of molecular functions, biological processes and cellular components. Genes from a number of defense-related pathways were observed in transcripts from each library cDNA. Numerous transcription factors were also identified, which are typically involved in regulation of plant development, signaling and response to environment, amongst others roles. Many are also known to be involved in signal transduction and expression regulation of stress-responsive genes. Over 99% of contig unigenes mapped to exon regions in the reference M. acuminata DH Pahang whole genome sequence. Furthermore, protein extraction was conducted from the inoculated and non-inoculated leaf materials. Isoelectric focusing was performed using the IPGphor system. A second dimension was performed using an SDS-PAGE gel at 12%, with gels stained with Coomassie Blue solution G-250. Gels were scanned using a scanner ImageScanner II (GE Healthcare), with image analysis performed using the software Image Master 2D Platinum 7.0 (GeneBio). Assays to detect common spots were also made at the same cultivar (control and treated), as well as the identification of differentially expressed spots, and detection of spots present in only one condition, called exclusive spots. In the resistant cultivar Calcutta 4, 7 spots were observed at least 1,5 times higher expression in the treated compared with the control. The expression pattern was different in the susceptible cultivar which showed 1 spot difference in expression between control and treated. The results of the proteomic analysis of this interaction can generate important information such as: types of expressed proteins, post-translation changes and responses to different environmental conditions, representing a link between genotyp and phenotypic information. Proteomic analysis, overlapping with transcriptome information for this pathosystem, generated by NGS sequencing, can potentially benefit future programs for genetic improvement of Musa in development of resistant genotypes