Resistência ao bean golden mosaic virus mediada por RNA interferente em plantas de feijoeiro (phaseolus vulgaris)

Abstract

A produção mundial de feijão, compreendendo os gêneros Phaseolus e Vigna, é superior a 18 milhões de toneladas e o Brasil ocupa o segundo lugar na produção mundial e o primeiro quando se trata apenas do gênero Phaseolus. Entretanto, sua produção ainda está aquém do necessário para suprir a demanda interna. Dentre os principais problemas relacionados com a baixa produção de feijão no Brasil estão a competição com plantas daninhas, estresse hídrico e o ataque de pragas e doenças como mosaico dourado do feijoeiro causado por um geminivírus. O Bean golden mosaic virus (BGMV), é transmitido por mosca-branca (Bemicia tabaci) de uma forma persistente, circulativa, causando mosaico dourado em feijão comum (Phaseolus vulgaris). Os sintomas característicos são: mosaico verde amarelado nas folhas, nanismo e vagens distorcidas. A doença é largamente disseminada nas regiões de produção de feijão no Brasil e América Latina causando perdas severas (40 -100%). Neste trabalho, a tecnologia de RNA interferente foi explorada usando uma seqüência do gene viral AC1 para gerar plantas transgênicas de feijão comum altamente resistentes a geminivírus. Desta maneira o gene viral (AC1) foi escolhido para a construção do vetor de transformação uma vez que a proteína Rep exerce uma função essencial no ciclo de infecção viral. Rep não é uma replicase porém é a única proteína requerida para a replicação do genoma viral. O vetor pBGMVRNAiAHAS foi construído a partir de um fragmento de DNA de 411 pb do gene AC1 do BGMV (_1836-2247, acesso no GeneBank No. M88686). Dezoito linhagens de feijão foram obtidas com a construção de interferência, as quais poderão induzir o silenciamento pós-transcricional do gene AC1. Uma linhagem (denominada 5.1) apresentou alta resistência (aproximadamente 93% das plantas não apresentaram sintomas) após alta pressão de inoculação (mais de 300 moscas-brancas virulíferas por planta). Os siRNAs específicos foram detectados nas plantas transgênicas, ambas inoculadas e não inoculadas. Uma análise de PCR semiquantitativo revelou a presença do DNA viral nas plantas transgênicas expostas a moscas-brancas virulíferas por um período de 6 dias. Entretanto, após a retirada dos insetos, não foi detectado DNA viral após um período adicional de seis dias. Devido à importância social e econômica do feijão na América Latina e à falta de genes para resistência a doenças nos bancos de germoplasma, faz-se necessário o desenvolvimento de um programa de melhoramento associado à engenharia genética para o lançamento de novas variedades, que possibilitará a diminuição dos principais problemas relacionados a esta cultura. ____________________________________________________________________________________ ABSTRACT

Production of beans, including the genus Phaseolus and Vigna, is superior to 18 million tons. Brazil is the secondlargest producer of both species genus and the major world producer of Phaseolus. However, its production is still below the necessary to supply the internal demand. Competition with weeds, abiotic stress and the occurrence of diseases as bean golden mosaic are some of the main problems related to its low production. Bean golden mosaic virus (BGMV), is transmitted by the whitefly Bemisia tabaci in a persistent, circulative manner, and causes the golden mosaic of common bean (Phaseolus vulgaris) which characteristic symptoms are yellow-green mosaic of leaves, stunting, and fruit distortion. The disease is the largest constraint on bean production in Brazil and Latin America and causes severe yield losses (40 to 100%). Here we explored the RNAi concept to silence the AC1 viral gene and generate high resistant transgenic common bean plants. Since the Rep protein performs an essential function in the viral infecting cycle, the AC1 gene was chosen to construct the transformation vector. Rep is not the replicase, but the only protein required for the replication of the viral genome. The vector pBGMVRNAiAHAS was constructed using the 411 bp fragment from the AC1 gene (_1836-2247, GeneBank accession No. M88686). Eighteen transgenic common bean lines were obtained with the construction to induce post-transcriptional gene silencing against AC1 gene. One line (named 5.1) presented high resistance (approximately 93% of plants free of symptoms) upon inoculation at high pressure (more than 300 viruliferous whiteflies per plant). Transgene-specific siRNA were detected in both inoculated and noninoculated transgenic plants. A semi-quantitative PCR analysis revealed the presence of virus DNA in transgenic plants exposed to viruliferous whiteflies for a period of six days. However, when insects were removed, no virus DNA could be detected after an additional period of six days. Due to its social and economical importance in Latin America and to the lack of genes for resistence, it is necessary to develop an improving program associated to genetic engineering in order to generate new varieties. It Shall allow the decreasing to the production of beans