Desenvolvimento de linhagem auxotrófica de Pichia pastoris para o metabolismo de leucina

Abstract

A levedura Pichia pastoris tem sido amplamente utilizada na produção de proteínas recombinantes devido a características como fácil manipulação, rápido crescimento e capacidade de fazer modificações pós-traducionais mais similares às dos mamíferos. Apesar do vasto uso desta levedura como sistema de expressão, há poucas marcas de seleção disponíveis para sua manipulação genética. As marcas existentes podem ser auxotróficas (genes de vias biossintéticas como HIS4, ARG4, URA3, ADE1, dentre outros) ou dominantes (geralmente genes que conferem resistência a drogas). O limitado número de marcas seletivas atualmente disponíveis restringe a construção de cepas de P. pastoris contendo mais de uma modificação genética. Nesse contexto, o objetivo deste estudo foi interromper, pela primeira vez, o gene LEU2 no genoma de P. pastoris com o fim de gerar uma linhagem auxotrófica para o aminoácido leucina que pudesse ser utilizada como hospedeira para vetores contendo este gene como marca de seleção. A ruptura gênica foi obtida pela transformação da levedura com um cassete de expressão contendo os genes kanR (resistência a kanamicina/G418) ou Sh ble (resistência a zeocina) flanqueados por regiões 5´ e 3´ do gene LEU2 para promover a recombinação homóloga neste locus. Para construir esse cassete de deleção o gene clonado LEU2 teve um fragmento de aproximadamente 400 pb excisado após digestão com enzimas de restrição sendo substituído pelo cassete de expressão flanqueado por sequências loxP. Após transformação e seleção de mutantes auxotróficos, a marca dominante foi removida. Para tanto, a levedura foi transformada com um vetor contendo o gene que codifica para a proteína CreA, uma recombinase sítio-específica que catalisa a reação de recombinação entre duas sequências loxP. Finalmente, para testar esta nova linhagem, foi construído um vetor contendo eGFP como gene repórter e o gene LEU2 como marca de seleção. A transformação da linhagem auxotrófica leu2 com esse vetor confirmou a recuperação da prototrofia e a capacidade da levedura para produzir a proteína heteróloga intracelularmente. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT

The yeast Pichia pastoris has been widely used for the production of recombinant proteins due to several characteristics such as easy genetic manipulation, fast growth and the ability to carry out post-translational modifications similarly to mammals. Despite the wide use of Pichia pastoris as expression system there are few selectable markers available for its genetic manipulation. The existing markers can be auxotrophic (genes of biosynthetic pathways, for example HIS4, ARG4, URA3, ADE1, among others) or dominant (mainly genes that confer drug resistance). The limited number of available selectable markers restricts the construction of strains with more than one recombinant modification. The aim of this study was to interrupt, for the first time, the LEU2 gene in the P. pastoris genome to generate an auxotrophic strain for the amino acid leucine which could be used as host strain for vectors carrying the LEU2 gene as selectable marker. The disruption was achieved transforming the yeast with an expression cassette that contained the kanR (kanamycin/G418 resistance) or Sh ble genes (zeocin resistance) flanked by regions from the LEU2 gene to promote homologous recombination at that locus in the P. pastoris genome. To construct that deletion cassette the cloned LEU2 gene had an excised fragment of approximately 400 bp after digestion with restriction enzymes. That fragment was substituted by the expression cassette flanked by loxP sequences. After transformation and selection of auxotrophic mutants the dominant marker was removed. To accomplish this, the yeast was transformed with a vector carrying the gene that codes for the CreA protein, a site-specific recombinase that catalyzes the recombination reaction between two loxP sequences. Finally, to test the new strain, it was constructed a vector containing eGFP as a reporter gene and the LEU2 gene as a selectable marker. Transformation of P. pastoris leu2 with that vector confirmed the recovery of the prototrophy and the ability of the yeast to produce the intracellular heterologous protein. ______________________________________________________________________________ RESUMEN

La levadura Pichia pastoris ha sido ampliamente utilizada para la producción de proteínas recombinantes debido a características como fácil manipulación, rápido crecimiento y la capacidad de realizar modificaciones postraduccionales similares a las de los eucariotas. A pesar del gran uso de esta levadura como sistema de expresión hay pocas marcas de selección disponibles para su manipulación genética. Las marcas existentes pueden ser auxotróficas (genes de vías biosintéticas como HIS4, ARG4, URA3, ADE1, entre otros) o dominantes (principalmente genes que confieren resistencia a drogas). El limitado número de marcas de selección disponibles actualmente restringe la construcción de cepas de P. pastoris con más de una modificación recombinante. En este contexto, el objetivo de este estudio fue interrumpir, por primera vez, el gen LEU2 en el genoma de P. pastoris con el fin de generar una cepa auxotrófica para el aminoácido leucina que pudiera ser utilizada como hospedera para vectores que tengan el gen LEU2 como marca de selección. La ruptura se logró al transformar la levadura con un casete de expresión que contenía el gen kanR (resistencia a kanamicina/G418) o el gen Sh ble (resistencia a zeocina) flanqueado por regiones del gen LEU2 para promover recombinación homóloga en ese locus del genoma de P. pastoris. Para esto se clonó el gen LEU2 y se digirió con enzimas de restricción para retirar un fragmento de aproximadamente 400 pb el cual se reemplazó por el casete de expresión flanqueado por secuencias loxP. Después de la transformación y selección de mutantes auxotróficos se removió la marca dominante. Para esto se transformó la levadura con un vector que contenía el gen que codifica para la proteína CreA, una recombinasa sitio-específica que cataliza la reacción de recombinación entre dos secuencias loxP. Finalmente para evaluar la nueva cepa se construyó un vector que contenía el gen eGFP como reportero y el gen LEU2 como marca de selección. La transformación de P. pastoris leu2 con este vector confirmó la recuperación de la prototrofía y la capacidad de la levadura para producir la proteína heteróloga intracelularmente.