Caracterização de múltiplas formas de xilanases produzidas por Aspergillus oryzae quando crescido em resíduos têxteis

Abstract

No presente estudo, multi-formas de xilanases, produzidas pelo fungo A. oryzae crescido em quatro resíduos têxteis – piolho de algodão limpo tratado e não tratado, e pó de filtro tratado e não tratado - foram purificadas e caracterizadas. A curva de indução enzimática do fungo nos resíduos indicou alta atividade xilanolítica a partir do segundo dia, mantendo-se constante ao longo de 14 dias. A suplementação com sulfato de amônio como fonte de nitrogênio, e utilização dos resíduos pré-tratados, aumentou a atividade das xilanases. Como os ultrafiltrados apresentaram maior atividade específica xilanolítica, deu-se continuidade com a purificação a partir destas frações. A xilanase xyl-1 foi purificada em apenas uma etapa cromatográfica, identificada por espectrometria de massa como endo-β-1,4-xilanase de tamanho 35,55 kDa. As outras xilanases foram parcialmente purificadas em uma etapa cromatográfica e por SDS-PAGE apresentaram massa molecular estimada entre 35 kDa e 22 kDa. O espalhamento de luz dinâmico (ELD) se apresentou como uma ferramenta eficaz em avaliar o grau de pureza das amostras, a presença de agregações e tamanho das enzimas. Como as leituras de ELD mostraram agregações enzimáticas, foi adicionado Tween-80 0,1%, que foi eficaz em desagregar as xilanases, além de não influenciar na atividade enzimática. Xyl-1 apresentou atividade catalítica máxima em pH 6,0, 50ºC, retendo 50% de sua atividade enzimática na faixa de pH 3,5-9,0. Xyl-1 também obteve maior afinidade ao substrato (fração solúvel de xilana de aveia) em comparação às outras estudadas (KM 4,45 mg/mL; VMáx 0,240 UI/mL). Além disso, as xilanases foram incubadas na presença de inibidores fenólicos provenientes da lignina e apresentaram ativação no lugar da inibição. E na presença do licor de auto-hidrólise de sabugo de milho também apresentaram ativação. Os resultados indicam que essas multi-formas de xilanase de A. oryzae possuem potencial para várias aplicações biotecnológicas. __________________________________________________________________________________ ABSTRACT

In this study, multiple-forms of xylanases produced by A. oryzae when grown in four textile wastes were purified and characterized. Wastes comprised–pre treated and untreated clean cotton and filter dust. The fungus displayed high amounts of xylanolytic activity from the second day onward, remaining constant up to 14 days. Growth media supplemented with ammonium sulfate as nitrogen source and with pre-treated residues increased the xylanase activity. Xylanase xyl-1 was purified in a single chromatographic step and identified as endo-β-1,4-xylanase by mass spectrometry with a molecular mass of 35.55 kDa. Other xylanases were partially purified in one chromatographic step. Based on zymograme, xyl-8 and xyl-9 presented a molecular mass of 35 kDa whilst xyl-6, xyl-7, xyl-9 and xyl-11 presented a mass of 22 kDa. Dynamic light scattering (DLS) was effective in evaluating the degree of purity of the samples, the presence of aggregations and size of the enzymes. As DLS showed enzyme aggregates, Tween-80 0.1% was added, which proved to be an efficient disintegrator agent and did not influence enzyme activity. Xyl-1 presented the highest catalytic activity at pH 6.0, 50°C, and retaining 50% of its enzymatic activity at pH 3,5-9,0. Xyl-1 also showed higher affinity to the substrate (soluble fraction of xylan oatspelt) compared to the others (KM 4,45 mg/mL; VMáx 0,240 UI/mL). Furthermore, the xylanases were incubated with phenolic inhibitors from lignin and displayed activation. The presence of an auto-hydrolysis liquor of corncob also showed activation. These findings indicate that multiple-forms of xylanases from A. oryzae offer potential in different biotechnological applications.