Mecanismos de resposta inflamatória em modelos murinos de Plasmodium berghei ANKA, suscetível ou não à malária cerebral

Abstract

A malária ainda é um importante problema de saúde global, acometendo milhões de pessoas e resultando em aproximadamente 1 milhão de mortes por ano. A forma cerebral é uma das complicações mais grave da infecção pelo Plasmodium falciparum em seres humanos, e sua patogênese não está ainda totalmente esclarecida. A hiperativação do sistema imunitário tem sido considerada um importante determinante da evolução para as formas graves. O desequilíbrio da resposta imunitária com polarização para a resposta inflamatória tem um papel central na hiperativação do endotélio vascular, no sequestro de eritrócitos parasitados na microvasculatura cerebral e nas lesões das células cerebrais. Os mediadores inflamatórios são liberados em resposta aos antígenos plasmodiais, às próprias citocinas, aos eicosanóides e a outros produtos como a hemozoína e heme livre, que estimulam diferentes vias de ativação e regulação intracelular. O objetivo deste trabalho foi avaliar os mecanismos da resposta inflamatória envolvidos nas alterações cerebrais em camundongos suscetíveis (CBA e C57BL/6) ou resistentes (BALB/c) à malária cerebral para melhor esclarecer os possíveis mecanismos imunopatogênicos determinantes das formas graves da doença e melhor caracterizar os modelos experimentais da malária. Foram utilizados para este estudo camundongos machos de 8 a 12 semanas de idade, infectados ou não com 106 eritrócitos parasitados pelo Plasmodium berghei ANKA. Para cada linhagem, a morte espontânea foi avaliada dia a dia e a parasitemia foi comparada entre eles no terceiro, quinto e oitavo dia da infecção. A produção de óxido nítrico foi determinada pela reação de Griess. O peróxido de hidrogênio foi determinado pelo teste de oxidação do vermelho de fenol na presença de peroxidase. As citocinas IL-1β, IL-4, IL-10, IL-12, IL-17 e o FNT-α foram quantificadas nos homogenatos do cérebro e cerebelo por teste imunoenzimático. A presença de COX-2 e 5-LOX foi avaliada nos macrófagos peritoneais e micróglia por citometria de fluxo, e nos vasos cerebrais e células cerebrais por imunohistoquímica. A ativação do metabolismo lipídico foi avaliada pela quantificação dos corpúsculos lipídicos no citoplasma dos macrófagos peritoneais pela técnica do Oil red e Bodipy. As vias de ativação do NF?B, o inflamassoma e a regulação pelo PPAR- ? foram avaliados no citoplasma e no núcleo dos macrófagos peritoneais. Cortes histológicos do cérebro também foram avaliados utilizando o método clássico de coloração pela hematoxilina-eosina e também por microscopia eletrônica de varredura. A permeabilidade vascular foi avaliada pela quantificação do extravasamento do corante de azul de Evans para o tecido cerebral. Os camundongos C57BL/6 começaram a morrer no sexto dia após a infecção, os camundongos CBA, dois dias depois, enquanto 55% dos camundongos BALB/c ainda estavam vivos no décimo quinto dia da infecção. A parasitemia nos camundongos C57BL/6 foi maior do que na linhagem BALB/c no terceiro e quinto dias após a infecção e no oitavo dia também foi maior do que nos camundongos CBA. Nos camundongos C57BL/6 houve ativação da via canônica do NF?B, e diminuição da produção de NO e aumento do H2O2, FNT-α e IL-10; não houve alteração na produção de IL-4, IL-12 e IL17; e houve aumento na formação de corpúsculos lipídicos e predominância da expressão de 5-LOX. Observamos também ativação do inflamassoma NALPR1, porém diminuição da produção IL-1β. Nos camundongos CBA houve ativação preponderantemente da via não-canônica do NF?B, diminuição da produção do FNT-α e da IL-10, não houve alteração da produção de IL-12, NO e H2O2, mas observamos um padrão de IL-4 e IL-17 maior do que o das outras linhagens. Houve também ativação do inflamassoma, mas não houve alteração na produção de IL-1β. Nos camundongos BALB/c houve ativação preponderantemente da via canônica do NF?B, mas não houve alteração na produção de IL-12, NO e H2O2, que são estimulados pela atividade desta via. Ainda observamos diminuição na produção de FNT-α e IL-1β. Observamos que houve aumento da formação de corpúsculos lipídicos, mas não houve aumento paralelo na expressão de COX-2 e 5-LOX. Entretanto, a linhagem BALB/c foi a única que apresentou uma translocação importante do regulador PPAR-γ para o núcleo. O perfil de resposta foi seguido de alterações histopatológicas características para cada linhagem, sendo os camundongos C57BL/6 os que apresentaram a maior permeabilidade e sequestro de leucócitos. Os camundongos CBA também apresentaram aumento de permeabilidade, porém menor do que os camundongos C57BL/6, e também apresentaram maior sequestro de eritrócitos do que leucócitos. Poucas alterações foram observadas nos camundongos BALB/c. Os resultados desse trabalho evidenciam diferentes mecanismos de respostas celulares que devem em conjunto ter contribuído para a evolução clínica da malária e mostram que a escolha do modelo experimental para pesquisas em malária deve levar em consideração a linhagem do camundongo e suas capacidades individuais de resposta. Além disso, indicam que a forma cerebral pode ser resultado de diferentes mecanismos fisiopatológicos. Provavelmente, esses resultados também expliquem as diferentes evoluções clínicas observadas da malária humana. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT

Malaria is one of the most important problems of public health, affecting millions people and resulting in almost one million death every year. Cerebral disease is one of the most severe complications of Plasmodium falciparum malaria and its immunopathogenesis is not well established. It has been considered that the excessive activation of the immune system by some parasite components is critical to the pathogenesis of severe malaria. The imbalance of immune response with polarization towards the inflammatory mechanisms plays a key role in the activation of endothelial vessels, in the sequestration of parasitized erythrocytes within the small vessels of brain and in cerebral cells lesions. The inflammatory mediators are released in response to plasmodial antigens, cytokines, eicosanoids and other products as hemozoin and free heme, which stimulates differently the activation and regulation of intracellular pathways. This work aimed at evaluating the inflammatory response which is involved in cerebral alterations in susceptible (CBA and C57BL/6) and resistant (BALB/c) mice to cerebral malaria, to better understanding of the immunopathological mechanisms and to better characterize the experimental murine models of malaria. In this work, 8-12 weeks-old male mice were infected with 106 Plasmodium berghei ANKA parasitized erythrocytes. For each strain, the survival rate and parasitemia were assessed. The nitric oxide production was evaluated by the Griess reaction and the hydrogen peroxide production was assessed by the Pick´s method. IL-1β, IL-4, IL-10, IL-12, IL-17 and TNF-α production in brain tissue were quantified by an ELISA test. The COX-2 and 5-LOX expression in microglia and peritoneal macrophages were analyzed in a flow cytometer. COX-2 and 5-LOX expression were evaluated in cerebral cells and vessels by immunohistochemistry. The lipid body formation is a hallmark of the activation of lipid metabolism and it was quantified in peritoneal macrophages by oil red O staining and bodipy fluorescent probe. The activation of NF?B pathway, inflammasome and PPAR-? were evaluated in the nuclei and cytoplasm of peritoneal macrophages. Histopathological evaluation of the brain was performed by hematoxilin-eosin staining and by scanning electron microscopy. Vascular permeability was measured by Evans blue dye extraction. The C57BL/6 mice began to die on the sixth day post-infection, CBA mice, two days later, while 55% of BALB/c mice still remained alive 15 days after infection. C57BL/6 mice showed the highest parasitemia compared with the two other strains. Only the canonical NF?B pathway was activated in C57BL/6 mice, there was a decrease in NO production, and an increase in H2O2, TNF-α e IL-10 levels after Plasmodium infection, but no alteration was observed in IL-4, IL-12 and IL-17 production; the lipid bodies formation was enhanced and 5-LOX was predominantly expressed. It was also observed the NALPR1 inflammasome activation, but the IL-1β production was decreased. The non-canonical NF?B pathway was more activated than the canonical one in CBA mice. They showed a decline in TNF-α and IL-10 productions, while no alteration in IL-12, NO and H2O2 was observed; the IL-4 and IL-17 pattern production was higher in these mice than in the other strains. The inflammasome was activated, but no production of IL-1β was observed. The BALB/c mice showed predominantly activation of the canonical NF?B pathway, but the products stimulated by the activity of this pathway, such as, IL-12, NO e H2O2 was not changed in infected animals, and even a decreased production of TNF-α and IL-1β was observed. There was an increased formation of lipid bodies, however, COX-2 and 5-LOX were not significantly expressed. In addition, higher translocation of PPAR-γ into the nuclei was observed in this resistant model. These profiles of responses were followed by histopathological alterations that were characteristics for each strain. The C57BL/6 mice showed the highest vascular permeability and leukocyte sequestration; the CBA mice also showed increased vascular permeability but lower than C57BL/6 mice, and they showed more erythrocyte than leukocyte sequestered. Few changes were observed in BALB/c mice. The results presented in this work suggest that different mechanisms of cellular responses may have contributed to determinate clinical malaria and showed that the choice of the experimental model for research on malaria should take into consideration the strain of mice and their individual capacities of responses. They also showed that the cerebral form of the disease may result from different pathophysiological mechanisms. Probably, these results may also explain the different clinical outcomes observed in human malaria.