Análise da expressão de genes envolvidos na interação inicial entre macrófagos murinos e Fonsecaea pedrosoi ou suas frações

Abstract

A cromoblastomicose é uma micose crônica, supurativa e granulomatosa desenvolvida no tecido cutâneo e subcutâneo, causada por vários fungos dematiáceos sendo o Fonsecaea pedrosoi, o principal fungo isolado de pacientes acometidos por esta doença. A parede celular deste fungo é composta pelas frações F1 (ß 1 3 glicana e quitina) e F2 (a 1 3 glicana e melanina), sendo importantes estruturas de reconhecimento pelo hospedeiro. Os eventos iniciais da ativação das células da resposta imune inata após a interação com o patógeno tem despertado grande interesse. Na resposta imune ao F. pedrosoi os macrófagos têm um papel fundamental no curso da infecção, pois estão envolvidas no desenvolvimento da resposta inflamatória granulomatosa e nos mecanismos microbicidas. Para que essas células produzam intermediários reativos microbicidas é necessário que sejam ativados, no curso da cromoblastomicose, F. pedrosoi é capaz de modular a ativação dos macrófagos, tornando os apenas fungistático. Uma forma de avaliar o padrão de ativação dos macrófagos, após contato com o patógeno, é analisar a expressão de genes envolvidos no reconhecimento, adesão do fungo e na produção de citocinas. Considerando que o perfil da expressão gênica de macrófagos após a interação com F. pedrosoi até o momento não foi analisado, o objetivo deste trabalho foi definir o padrão de expressão dos genes (Itga5, Clec2, Cd14, Tlr2, Tlr4, Myd88, Nf?b, N?rf e Tnf$a ) envolvidos nas etapas iniciais de interação (30min, 1h, 3h, 6h e 24h) com o fungo ou seus componentes de parede isolados. Quando analisamos a modulação da expressão de genes pela interação entre macrófagos e os conídios, os resultados demonstram que houve o aumento no número de transcritos do gene Tlr4 e Myd88 (em 30min) e Cd14 e Tlr2 (em 6h), embora os transcritos dos genes que participam da ativação da via de sinalização do NF ?B (Nf?B, Tnf$a e N?rf) não tenham sido detectados. Quando analisamos a interação entre macrófagos e a fração F1 de F. pedrosoi, vimos que houve aumento do número de transcritos nos genes Cd14, Tlr2, Nf?B e Tnf$a (em 6h) e repressão para o gene N?rf, apontando para uma sinalização da via de NF ?B, sendo possível sugerir que a interação entre o macrófago e essa fração pode modular a ativação dessa célula. Para a interação entre macrófagos e a fração F2, o tempo mais expressivo também foi de 6h, quando houve aumento no número de transcritos dos genes Clec$2, Nf?B e Tnf$a, com repressão do gene N?rf, sugerindo que essa fração parece modular a resposta do macrófago ao fungo, através do indução de transcritos do gene Clec$2 inicialmente. Os resultados sugerem que os componentes de parede celular do fungo F. pedrosoi após interagirem com macrófagos são capazes de modular os genes destas células, aumentando a capacidade destas células de reconhecer os componentes da parede celular do fungo, com subseqüentes mudanças funcionais, que a tornam incapaz de eliminar esse fungo. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT

The chromoblastomycosis is a chronic, suppurative and granulomatous mycosis that affects the skin and subcutaneous tissue and is caused by various different dematiaceous fungi. Fonsecaea pedrosoi is the main fungus isolated from patients suffering from this disorder. The cell wall of this fungus is composed by two fractions – the F1 fraction (β- 1-3-glucan and chitin) and the F2 fraction (α-1-3-glucan and melanin). These structures are important in the recognition of the fungus by the host immune system. Macrophages play a key role in the initial events of the innate immune reaction to this pathogen since they are involved in the developmental of a granulomatous inflammatory response and bactericidal activity. The macrophage microbicidal activity depends on reactive intermediates that need to be activated during the course of chromoblastomycosis. However, F. Pedrosoi is capable to modulate the activation of the macrophages reducing their activity only to fungistatic. The analysis of the expression of the genes involved in the recognition and adhesion of the fungus and the production of cytokines is a way to assess the pattern of activation of macrophages after their contact with the pathogen. The gene expression profile of the macrophages after their interaction with F. pedrosoi has not been analyzed so far. Consequently the aim of the present study was to define the expression pattern of the genes (Itga5, Clec2, Cd14, Tlr2, Tlr4, Myd88, Nfκb, Nκrf and Tnf-α) involved in the initial stages of interaction of the macrophage with the fungus or the distinct components of its wall (at 30min, 1h, 3h, 6h and 24h). The analysis of the modulation genes expression caused by the interaction between macrophages and conidia disclosed an increase in the number of transcripts Tlr4 and Myd88 (at 30min) and of Cd14 and Tlr2 (at 6h), although transcripts of genes participating in the activation of the signaling pathway of NF-κB (Nfκb, Tnf-α and Nκrf) could not been detected. In addition, the analysis of the interaction between macrophages and the fraction F1 of F. pedrosoi showed an increased in transcripts of the genes Cd14, Tlr2, Nfκb and Tnf-α (at 6h) and inhibition of the gene Nκrf, pointing to a signaling pathway of NF-κB, which suggests that the interaction between this fraction and the macrophage can modulate the activation of this cell. The analysis of the interaction between macrophages and the fraction F1 of F. pedrosoi, disclosed an increased numbers of transcribed genes Cd14, Tlr2, Nfκb and Tnf-α (at 6h) and repression of the gene Nκrf, pointing to a signaling pathway of NF-κB, which might suggest that the interaction between this fraction and the macrophage can modulate the activation of this cell. In considering the interaction between macrophages and the fraction F2 the time with more expression was also at 6 hours when an increase in the number of transcripts of the genes Clec-2, Nfκb and Tnf-α was detected, with simultaneous repression of the Nκrf gene, which suggests that this fraction apparently initially modulate the macrophage response to the fungus through the induction of the gene transcript Clec-2. These results suggest that components of the fungal cell wall of F. pedrosoi, after interacting with macrophages are able to modulate the genes of these cells, increasing their capacity to recognize the components of the fungal cell wall, with subsequent functional changes, which result in their inability to eliminate the fungus.