Comparação entre o congelamento lento e a vitrificação na criopreservação de tecido ovariano de suínos

Abstract

Os avanços nas tecnologias reprodutivas têm aumentado o aproveitamento do material genético de animais de interesse zootécnico ou ameaçados de extinção. A criopreservação de ovócitos imaturos inclusos no tecido ovariano é uma alternativa para a preservação de diversas espécies, particularmente em suínos, visto que ovócitos maduros desse grupo são extremamente sensíveis a baixas temperaturas. A escolha da técnica de criopreservação (congelamento lento ou vitrificação) interfere na eficiência de preservação do material, por isso, são necessários estudos que visem o desenvolvimento de protocolos de conservação das células germinativas inclusas em folículos pré-antrais (FPA) suínos. O objetivo deste trabalho foi comparar o efeito de técnicas de criopreservação, congelamento lento e vitrificação, na morfologia de FPA inclusos no tecido ovariano de suínos. Os fragmentos do tecido ovariano foram submetidos a dois protocolos de vitrificação (V1 e V2) e um de congelamento lento (CL), vitrificados em superfície sólida ou congelados em um freezer programável. Na V1, os fragmentos foram imersos em uma solução de equilíbrio (SE) de DMSO 1,0 M e uma solução de vitrificação (SV) de DMSO 2,0 M + acetamida 1,0 M + propanodiol 3,0 M. Para a V2, utilizou-se SE contendo etilenoglicol 0,6 M e SV contendo etilenoglicol 5,6 M + polivinilpirrolidona 0,45 M e 13,7% sacarose. Para o CL, os fragmentos foram colocados em criotubos com solução de etilenoglicol 1,5 M e 0,4% sacarose. As amostras foram congeladas pelo método lento ou vitrificadas em superfície sólida e todos os fragmentos foram armazenados em nitrogênio líquido. Após o reaquecimento ou descongelamento, as amostras foram fixadas e processadas para microscopia de luz e eletrônica de transmissão. Os dados das porcentagens de folículos morfologicamente normais (FMN) foram submetidos ao teste de Tukey. As médias de FMN foram 97,1±2,6 para o controle, 96,1± 3,0 para a V1, 81,1±14,8 para a V2 e 86,7±7,3 para o CL. As porcentagens de FMN no CL e na V2 foram estatisticamente menores (P<0,05) que a do controle e a da V1, a qual por sua vez foi estatisticamente igual ao controle. Para a análise ultraestrutural, foram avaliados apenas FPA caracterizados como morfologicamente normais nos cortes semi-finos, e somente dos melhores tratamentos. A ultraestrutura celular de FPA criopreservados pelo método V1 apresentou vários sinais de degeneração, enquanto FPA congelados pela técnica CL apresentaram morfologia normal, semelhante ao controle. Em conclusão, a técnica de CL foi mais eficiente para preservar folículos pré-antrais inclusos em tecido ovariano de suínos, entretanto o aperfeiçoamento da técnica de vitrificação para tecido ovariano suíno ainda é necessário.