Caracterização estrutural e funcional de fenilseptinas : peptídeos com atividades antimicrobiana e químico-sensorial presentes na secreção cutânea de Hypsiboas punctatus

Abstract

As toxinas de origem vegetal, animal e microbiana há muito despertam o interesse do homem. Assim, a busca por moléculas bioativas que permitam uma ampla biblioteca informativa surge como alternativa na busca de soluções de problemas agrícolas e farmacológicos. A pele dos anfíbios é uma rica fonte destas moléculas, as quais são produzidas pelas glândulas serosas holócrinas do tegumento, as quais estão localizadas nos grânulos do lúmem, e são liberadas sob a presença de estímulos apropriados. Suas funções são variadas, atuando tanto na regulação das funções fisiológicas da pele, como na defesa contra predadores e microrganismos. As moléculas mais estudas são os peptídeos antimicrobianos (PAM), os quais atuam diretamente na defesa química contra patógenos. Neste trabalho, foi estudada uma nova classe de PAM presentes na secreção cutânea do anuro Hypsiboas punctatus, as fenilseptinas (Phes). Estas são peptídeos antimicrobianos de 18 resíduos de aminoácido (FFFDTLKNLAGKVIGALT-NH2), com massa molecular M+H+=1954.2, as quais ocorrem naturalmente na forma de uma mistura racêmica (L-/D-Phes), e apresentam propriedades sensoriais. A enantiomerização do resíduo de aminoácido Phe2 e a amidação C-terminal foram estudadas e confirmadas por uma combinação de técnicas incluindo RP-UFLC, espectrometria de massa combinada com mobilidade iônica, experimentos de MS/MS de alta resolução, sequenciamento de cDNA, síntese de peptídeos em fase sólida e sequenciamento N-terminal por degradação de Edman. Os estudos detalhados das 20 estruturas de menor energia obtidas por experimentos de 1H RMN demonstram que os peptídeos assumem uma conformação de α-hélice dos resíduos 5-18 (RMSD 0.22 ± 0.09), e existe em D-Phes uma de mudança de 90° na orientação da porção N-terminal 1-3. Os peptídeos foram ativos contra bactérias gram-positivas e gram-negativas em ensaios de determinação da atividade antimicrobiana in vitro (e.x. S. aureus -65,5 e 32,7 μM, L-Phes e D-Phes, respectivamente). E, as mesmas moléculas foram testadas em camundongos às propriedades gustativas, em um sistema de animais KO para um canal iônico essencial para a transdução do sabor amargo e doce (Trpm5). Os camundongos WT rejeitaram os peptídeos (p < 0,05), enquanto que os camundongos KO foram indiferentes aos mesmos (p > 0,3). Provavelmente, as divergências estruturais são mais relacionadas com as diferenças observadas em relação às atividades antimicrobianas diferenciadas entre as duas moléculas, do que com as propriedades sensoriais. Fenilseptinas representam o primeiro relato de moléculas antimicrobianas, com propriedades sensoriais e enorme plasticidade estrutural. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT

Toxins from plant, animal and microorganism long light the interest of man. Thus, the search for bioactive molecules that allow a large databank appears as an alternative looking for solutions to agricultural problems and pharmacological. Amphibian skin secretions is a rich source of these molecules, which are produced by serous holocrine glands, which are located in the lumen of the granules and are released in the presence of appropriate stimuli. Their functions are diverse, acting both in the regulation of physiological functions of the skin, as in defense against predators and microorganisms. The molecules most studied are the naturally occurring antimicrobial peptides (AMP), which act directly on the chemical defense against pathogens. Here we report a new class of AMP present in the skin secretions of anuran Hypsiboas punctatus, the fenilseptina (Phes). These are antimicrobial peptides of 18 amino acid residues (FFFDTLKNLAGKVIGALT-NH2), with a molecular mass of M+H+ = 1954.2, that was purified as two naturally occurring D- and L-Phe analogs, with sensorial properties. The amino acid epimerazition and C-terminal amidation for both molecules (in short, D-Phes and L-Phes) were confirmed by a combination of techniques including reverse-phase UPLC, ion mobility mass spectrometry, high resolution MS/MS experiments, Edman degradation, cDNA sequencing and solid-phase peptide synthesis. RMSD analysis of the twenty best 1H NMR structures of each peptide revealed that the peptides assume an α-helical conformation of residues 5-18 (RMSD 0:22 ± 0.09), and there is D-Phes has a major 90° difference between the two backbones at the first four N-terminal residues and substantial orientation changes of the respective side chains. The peptides were active against gram-positive and gram-negative in vitro assays (S. aureus -65.5 and 32.7 mM, L-and D-Phes Phes, respectively). And the same molecules were tested in mice to evaluate the properties in a system of KO animals to a ion channel essential for transduction of bitter and sweet (Trpm5). The mice rejected the WT peptide (p < 0.05), while the KO mice were indifferent to them (p > 0.3). These structural divergences are most likely linked to the quantified differences in antimicrobial potencies determined for both molecules, but produced no detectable change in the gustatory aversive behavior. Perhaps the Phenylseptins are early examples of the amazing plasticity of small biomolecules yet to be understood.