Desenvolvimento, caracterização e uso de marcadores microssatélites no mapeamento genético de características agronômicas de cajueiro (Anacardium occidentale L.)

Abstract

O cultivo do cajueiro é observado em quase todos os estados do Brasil. Contudo, adapta-se melhor ao ambiente do litoral nordestino. Essa cultura tem grande importância para a agroindústria dos Estados do Ceará, Piauí e Rio Grande do Norte, onde são colhidos 95% da produção brasileira e onde é feito todo o processamento da castanha. O agronegócio do cajueiro movimenta cerca de 157 milhões de dólares somente em exportações de amêndoas. Apesar da importância sócio-econômica da cajucultura, esta exploração, no entanto, ainda não é intensa em tecnologia. O uso de técnicas modernas de genética molecular no melhoramento genético do cajueiro pode ser decisivo para a mudança do atual perfil deste importante agronegócio pela possibilidade de aumento da produtividade e qualidade dos seus produtos. Até o presente, são poucas as informações sobre marcadores moleculares, genes e regiões cromossômicas que controlam caracteres de importância econômica no cajueiro. Este trabalho teve como objetivo desenvolver e caracterizar uma bateria de marcadores microssatélites de Anacardium occidentale a partir da construção de bibliotecas genômicas enriquecidas para seqüências repetitivas. Os marcadores desenvolvidos foram utilizados em estudos de vínculo genético entre amostras do banco de germoplasma. Foi desenvolvido um esforço de localização dos novos marcadores microssatélites nos mapas genéticos existentes da espécie. Dos 5.472 clones potencialmente contendo fragmentos repetitivos, 540 foram seqüenciados e analisados para a presença de microssatélites. Uma bateria de 117 sequências foi selecionada com base na qualidade das sequências microssatélites que cada clone apresentava, e submetida a desenho de iniciadores de PCR para a realização de testes genéticos. Deste total, cem novos pares de iniciadores foram sintetizados e otimizados para genotipagem através de eletroforese em gel de agarose a 3,5%. Quatorze novos marcadores microssatélites foram selecionados ao acaso e analisados em seqüenciador 377 ABI com base na genotipagem de 36 acessos do Banco de Germoplasma de Cajueiro. Esta análise permitiu a estimativa de parâmetros genéticos como Heterozigosidade observada (Ho), Heterozigosidade esperada (He), Conteúdo de Informação Polimórfica (PIC) e Poder de Exclusão (PE) de cada um dos quatorze marcadores microssatélites. O experimento permitiu detectar grande variabilidade de performance analítica entre os marcadores testados. O marcador AOBR 48, por exemplo, demonstrou ser o marcador com o maior Conteúdo de Informação Polimórfica, Heterozigosidade observada e Poder de Exclusão entre os marcadores testados. A análise de acessos do Banco de Germoplasma com os quatorze novos marcadores microssatélites indicou que os acessos de cajueiro comum e de cajueiro anão precoce formam grupos distintos com base nos valores de coeficiente de similaridade estimados em comparações par-a-par entre os 36 acessos de cajueiro estudados. Um acesso de A. microcarpum, utilizado como controle externo (outgroup), foi agrupado com acessos de cajueiro comum, chamando a atenção para a necessidade de aprofundamento no estudo das relações filogenéticas entre A. occidentale e A. microcarpum. Uma população F1 derivada do cruzamento entre cajueiro anão precoce (CCP1001) e cajueiro comum (CP 96) foi utilizada para mapear os novos marcadores microssatélites no genoma de cajueiro. Entre os cem novos marcadores desenvolvidos neste trabalho, 11 apresentaram segregação de alelos do genitor feminino (CCP 1001) na população F1, enquanto que 21 apresentaram segregação de alelos do genitor masculino (CP 96). Somente três dos 100 marcadores testados apresentaram segregação de alelos dos dois genitores na população F1, totalizando 29 marcadores passíveis de mapeamento nesta população. No total, 11 marcadores SSR desenvolvidos no atual trabalho foram incorporados aos mapas dos genitores masculino e feminino, sendo apenas um marcador comum aos dois genitores. O mapa genético do genitor masculino (acesso CP 96) apresentou o total de 106 marcadores distribuídos em 1.133,6 cM, e o mapa do genitor feminino (CCP 1001) apresentou um total de 99 marcadores distribuídos em 1.065,9 cM. Os novos marcadores estão sendo empregados na análise genética e no melhoramento do cajueiro. Neste trabalho, foram mapeados QTLs (Quantitative Trati Loci) de três características de importância econômica de cajueiro: resistência a mofo-preto (causado pelo fungo Pilgeriella anacardii), altura da planta e diâmetro da copa. No mapa do genitor feminino, foram detectados três QTLs para a altura da planta, um para a característica diâmetro da copa e um para resistência a mofo-preto. Já no mapa do genitor masculino, foram detectados três QTLs para a característica resistência a mofo-preto, dois para a característica altura da planta e dois para o diâmetro da copa. Os novos marcadores microssatélites de cajueiro enriquecem o conjunto de ferramentas genômicas que está sendo construído para apoiar e tornar mais eficiente o melhoramento genético da espécie. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT

The cashew tree is cultivated in almost all states of Brazil. However, it is better adapted to the environmental conditions of the Brazilian NorthEastern Coast. This crop is particularly important for the agricultural sector of the states of Ceará, Piauí and Rio Grande do Norte. These three states are together responsible for 95% of the Brazilian cashew production and virtually all cashew nut processing. The cashew agribusiness responds for approximately 157 million dollars per year only on cashew nut exports. Although cashew business is socially and economically important, cashew production is not intensive in technology use. The application of modern molecular genetics techniques in cashew breeding can be decisive to promote a change in the current production standards of this important agribusiness due to the possibility of increasing yields and promoting increments in fruit and nut quality. There is very limited information about cashew molecular markers, genes and genomic regions associated with economically important traits. The objectives of the present work were to develop and characterize a group of microsatellite markers for Anacardium occidentale based on the construction of repetitive DNA enriched genomic libraries. The molecular markers which were obtained were used to study the genetic relationships between cashew accessions of the Germplasm Bank. An attempt was also made to locate the new molecular markers on the genetic maps already developed for the species. A library of 5,472 DNA clones potentially rich on repetitive sequences was developed and used to select 540 clones for DNA sequencing. The sequences obtained were checked out for the presence of microsatellite sites. A total of 117 sequences were then selected based on quality criteria and submitted to primer designing for PCR validation. Validation of a set of one hundred new microsatellite markers was then conducted on 3.5% agarose gel electrophoresis. A subgroup of 14 new microsatellite markers was selected and used to genotype a collection of 36 cashew tree samples on a 377 ABI DNA sequencer. The data obtained allowed to estimate genetic parameters such as observed Heterozigosity (Ho), expected Heterozigosity (He), Polymorphism Information Content (PIC) and Power of Exclusion (PE) of each of the 14 microsatellite markers. A great diversity of analytical performance was observed among the tested markers. Marker AOBR 12 48, for example, presented the highest PIC, Ho and Power of Exclusion among the tested markers. The analysis of 36 accessions of cashew with the 14 new microsatellite markers indicated that the accessions of dwarfs and common types of cashew are clustered in distinct groups according to similarity coefficient values. An accession of A. microcarpum used as outgroup clustered with accessions of common cashew. This points out to the necessity of developing filogenetic studies between A. occidentale and A. microcarpum. An F1 population obtained upon crossing a dwarf tree (CCP1001) with a common type cashew tree (CP 96) was used to map the new developed markers. Among the 100 new microsatellite markers, 11 showed segregation for the female parent (CCP 1001) in the F1 populaiton, and 21 for the male parent (CP 96). Only three of the 100 markers showed segregation for the two parents in the F1 population. Eleven SSR markers developed in the current work have been located in the male and female linkage maps, but only one marker is common to both maps. The male parent genetic map (CP 96) includes 106 molecular markers covering 1,112.6 cM, while the female parent map (CCP 1001) includes 99 molecular markers covering 1,065.9 cM. The new markers are being used in cashew genetic analysis and breeding. In this work, a QTL analysis was performed for three traits of economic importance for cashew production: resistance to black mold, caused by the fungus Pilgeriella anacardii, plant height and canopy diameter. Three QTLs for plant height, as well as QTLs for canopy diameter and black mold have been located on the female parent map. Two QTLs for canopy diameter, two QTLs for plant height and three QTLs for resistance to black mold have been mapped on the male parent linkage map. The new cashew microsatellite markers enrich the group of genomic tools currently being developed to support and increase the efficiency of cashew breeding.