Regulação da expressão do gene de Glicana sintase 1 (PbFKS1) pelo fator transcricional PacC em Paracoccidioides brasiliensis

Abstract

Paracoccidioides brasiliensis, agente etiológico da paracoccidioidomicose, é um fungo termodimórfico e sua patogenicidade está ligada ao processo de transição dimórfica e a alterações na parede celular. Em P. brasiliensis, os principais polímeros que compõem a parede celular são a 1,3-?-glicana e a 1,3-?-glicana, responsáveis pela forma e integridade estrutural. Neste estudo investigou-se a região promotora do gene de 1,3-?-glicana sintase (PbFKS1). Foram encontrados na região regulatória de PbFKS1 dois sítios consensuais para a ligação do fator transcricional CreA, envolvido na repressão por glicose, e dois sítios de interação para o fator PacC, relacionado à regulação da expressão gênica mediada pelo pH extracelular em fungos. Experimentos de retardo de mobilidade eletroforética (EMSA) foram realizados com três sondas fluorescentes distintas: Pbfks1 (I), que apresenta um dos sítios CreA; Pbfks1 (II), que representa um sítio para PacC e Pbfks1 (III), na qual estão presentes um sítio para CreA e um sítio para PacC espaçados por sete nucleotídeos. Foram empregados, nos experimentos de EMSA, proteínas recombinantes contendo os domínios de ligação ao DNA de CreA e de PacC fusionados à glutationa-S-transferase, e extratos protéicos totais de P. brasiliensis nas fases de micélio e de levedura, crescido em pH ácido (5,0), neutro (7,0) ou alcalino (9,0). Os resultados de EMSA indicaram que os sítios de CreA do gene PbFKS1 não foram reconhecidos pela proteína rCreA-GST. Quando da incubação com extratos protéicos totais obtidos de células leveduriformes ou miceliais, houve a formação de complexos DNA-proteína, mas esses não envolviam o sítio de reconhecimento de CreA. Os experimentos realizados com as duas sondas que apresentam o motivo de reconhecimento de PacC indicaram a formação de complexos entre a proteína rPacC-GST e o motivo de reconhecimento específico. Os ensaios feitos com extratos protéicos totais resultaram na detecção de interação DNA-proteína específica no sítio PacC apenas na forma de levedura, cultivada em pH neutro ou alcalino. Os dados obtidos nesse trabalho indicam que o fator transcricional PacC possa estar envolvido na regulação da expressão do gene PbFKS1 quando do crescimento leveduriforme, forma celular em que ocorre no hospedeiro infectado. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT

Paracoccidioides brasiliensis, the etiological agent of paracocciodioidomycosis, is a thermodimorphic funjgs. Pathogenicity is linked to modifications of the cell wall during the dimorphic transition. P. brasiliensis major cell wall polymers are 1,3-β-glican and 1,3-α-glican, which are responsible for structural form and integrity. In this study the promoter region of the 1,3-β-glican synthase (PbFKS1) gene was investigated. In the PBFKS1 regulatory region we found two consensus binding sites for the CreA transcription factor PacC, which is related to the gene expression regulation mediated by extracellular ph in fungi. Electrophoretic mobility shift assays (EMSAs) were performed with tree distinct fluorescent probes: Pbfs1 (I), which presents one of the CreA recognition sites; Pbfs1 (I), wich represents a PacC are spaced by binding site; and Pbfks 1 (III), in wich one site for CreA and one for PAcC are spaced by seven nucleitides. For the EMSAs, we employed recombinant proteins containing the CreA or the PacC DNA-binding domaun fused to glutathione-S-transfere (rCreA-GST and rPacC-GST, respectively), as well as total proteins extractus obtained from P. brasiliensis mycelium and yeast cells grown in acidic (5.0), neutral (7.0) or alkaline (9.0) Ph. EMSAs results indicated that the CreA binding sites present in the PbFKS1 gene regulatory region were not recognized by the rCreA-GST protein. When probes were incubated with total protein extracts obtained either from yeast or mycelium cells, DNA-protein complxes were formed ; nevertheless, these complexes did not invole the CreA specific recognition site.Experiments performed with the two PacC probes indicated the formation of complexes between rPacC-GST and the Specific DNA_protein interactions in the PAcC binding site only in the yeast phase grown in neutral or alkaline ph.The data obtained in the work indicative that the transcriptions factor PacC can be involved in the regulations of PbFSk1 gene expression during the yeast phase growth, which is the cell form that occurs in the infected host.