Edição gênica para deleção seletiva de subunidades de receptores de opsonina em macrófagos murinos

Abstract

A criptococose, causada principalmente pelas leveduras do complexo Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii, permanece como um grave problema de saúde pública global, com altas taxas de mortalidade em indivíduos imunocomprometidos. A interação inicial entre o fungo e os macrófagos alveolares é crítica para o desfecho da infecção, sendo mediada por diversos receptores de superfície, incluindo as integrinas. No entanto, o papel funcional específico das integrinas ITGAM (CD11b), ITGAX (CD11c), ITGB1 (CD29) e ITGB2 (CD18) na fagocitose e controle do Cryptococcus ainda não está totalmente elucidado. Este estudo teve como objetivo principal gerar linhagens de macrófagos murinos (J774) com deleções gênicas (knockout) para estas integrinas, utilizando o sistema de edição gênica CRISPR-Cas9 mediado por vetores lentivirais. Adicionalmente, realizou-se um levantamento epidemiológico descritivo da mortalidade por criptococose no Distrito Federal entre 2013 e 2024, utilizando dados do SIM/DATASUS. A metodologia experimental envolveu a construção de um vetor lentiviral customizado contendo a nuclease Cas9 sob um sistema de expressão induzível por doxiciclina (Tet-On) e o gene repórter EGFP, controlados pelo promotor mínimo CMV. Após a validação dos plasmídeos e produção viral em células HEK293T, os macrófagos J774 foram transduzidos e submetidos a um protocolo otimizado de seleção com os antibióticos G418 e Puromicina. Os resultados epidemiológicos revelaram a persistência de óbitos por criptococose no Distrito Federal, com predominância em indivíduos do sexo masculino, acima de 50 anos e com baixa escolaridade. Na vertente experimental, obteve-se êxito no estabelecimento de populações celulares J774 duplamente resistentes aos antibióticos de seleção. Contudo, a indução com doxiciclina falhou em promover a expressão detectável da proteína de fusão Cas9-EGFP. Consequentemente, a análise por citometria de fluxo demonstrou a ausência de redução significativa na expressão das integrinas de superfície, indicando que a edição gênica não ocorreu. A discussão aponta que, apesar da integração bem-sucedida dos cassetes de resistência, o sistema de expressão induzível falhou provavelmente devido ao silenciamento epigenético do promotor viral CMV na linhagem de macrófagos J774. Conclui-se que, embora o trabalho tenha estabelecido uma plataforma validada para seleção e cultura de células transduzidas, o sistema de promotor escolhido é inadequado para esta linhagem celular específica. Como perspectiva futura, sugere-se a substituição do promotor CMV por promotores constitutivos robustos, como o EF1α, para superar o silenciamento gênico e viabilizar o estudo funcional dessas integrinas na interação patógeno-hospedeiro.