Alidação Analítica do Método de Quantificação Espectrofotométrica De β-glicosidase e Arilsulfatase em Solos

Abstract

Este trabalho teve como objetivo validar e otimizar os métodos espectrofotométricos para a determinação da atividade das enzimas β-glicosidase e arilsulfatase em amostras de solo, com ênfase na comparação entre os métodos de Calibração Externa e Adição de Padrão e na avaliação dos principais parâmetros de validação analítica, como linearidade, sensibilidade, limites de detecção (LD) e quantificação (LQ), precisão, estabilidade e faixa linear de trabalho. A análise comparativa entre os métodos de padrão externo e Adição de Padrão foi conduzida por meio do confronto entre as curvas de Calibração Externa e de Adição de Padrão para a β-glicosidase. A comparação entre esses dois métodos foi realizada por meio do teste t de Student para duas médias independentes (95%) e indicou diferença significativa nos resultados obtidos por eles (tcal = 7,14 > ttab = 4,303), sem equivalência estatística, embora com forte correlação entre o conjunto de dados fornecido pelos dois métodos (r = 0,9989) e subestimação da quantidade de pNP fornecida pela Calibração Externa. Essa comparação metodológica permitiu inferir que é necessário empregar estratégias de correção, para assegurar maior confiabilidade metrológica nas determinações enzimáticas, quando utilizado o método de Calibração Externa. As curvas em 400 e 420 nm para ambas as enzimas apresentaram R² > 0,990 atendendo ao critério estabelecido pela RDC nº 166/2017 da Anvisa. O comprimento de 400 nm foi mais sensível (β-glicosidase: LD= 3,83 e LQ= 11,62; Arilsulfatase: LD= 5,42 e LQ= 16,43). Entretanto, o de 420 nm mais adequado para altas concentrações (β-glicosidase: LD= 4,98 e LQ= 15,09; Arilsulfatase: LD= 6,46 e LQ= 19,58). As faixas lineares foram de 5–125 µg de pNP (β-glicosidase) e 10–125 µg de pNP (arilsulfatase). Os reagentes pNG, pNS e pNP apresentaram estabilidade excelente durante os 125 dias de verificação. Na secagem do solo, no período de estiagem, houve perda de massa até o 13º dia, reabsorção entre o 15º e o 18º e posterior estabilização; no período chuvoso, perda até o 9º dia, reabsorção entre o 10º e o 15º e estabilização a partir do 17º. Em conjunto, os resultados confirmaram que os métodos validados apresentam robustez, precisão, sensibilidade adequada e conformidade com os critérios regulatórios vigentes, demonstrando viabilidade para aplicação em análises de rotina e em estudos ambientais voltados à avaliação da atividade enzimática em solos.