Análise de microRNAs séricos em pacientes diagnosticados com Transtorno Comportamental do Sono REM - estudo de métodos de purificação e quantificação por RT-qPCR e expressão relativa de miR-7 e miR-19b

Abstract

A descoberta de moléculas com expressão alterada no sangue periférico de pacientes diagnosticados com distúrbios neurodegenerativos é um tema relevante na neurologia, tanto para fins diagnósticos quanto para o prognóstico clínico. Esse conceito se aplica ao Transtorno Comportamental do Sono REM isolado definido clinicamente (TCSREMi), um distúrbio caracterizado pela perda da atonia muscular durante o sono, levando à encenação de sonhos, o que pode evoluir para outras neuropatologias. A caracterização de moléculas com expressão aberrante contribuirá para a melhor compreensão dessa doença, além de auxiliar na identificação de indivíduos com risco de conversão fenotípica de TCSREMi para sinucleinopatias, como a Doença de Parkinson, a demência por corpos de Lewy e a atrofia de múltiplos sistemas. Entre os possíveis biomarcadores sanguíneos do TCSREMi, destacam-se os microRNAs, que são RNAs não codificantes que regulam o conteúdo de RNAs mensageiros em nível pós-transcricional. Contudo, a detecção precisa de microRNAs, especialmente os de baixa abundância, requer ensaios científicos cuidadosamente padronizados para purificar os RNAs de outros constituintes do soro e para quantificar os alvos de interesse por RT-qPCR. O presente estudo comparou duas metodologias de purificação de RNAs e duas metodologias de RT-qPCR voltadas à quantificação de microRNAs relevantes na neurobiologia e em exames moleculares do TCSREMi, definido clinicamente: miR-7 e miR-19b. Foram utilizados dois grupos experimentais: indivíduos diagnosticados com TCSREMi e indivíduos controles saudáveis. Inicialmente, verificou-se que a purificação de RNAs pela metodologia que utiliza tiocianato de guanidina (Kit miRNeasy Serum Plasma Advanced, Qiagen, método 1) apresenta rendimento significativamente superior à metodologia convencional que utiliza separação de fases aquosa e orgânica por fenol-clorofórmio (miRNeasy Serum Plasma, Qiagen, método 2). Os métodos de purificação 1 e 2 renderam, respectivamente, 1,46 ng/µL e 0,75 ng/µL (P < 0,05) no grupo com TCSREMi. Quanto às metodologias de RT-qPCR, ambas utilizaram o sistema TaqMan e foram executadas com kits comerciais (Applied Biosystems), sendo as reações calibradas pelo controle endógeno miR-21 e pelo controle exógeno spike-in miR-39 de C. elegans. Foram comparados dois sistemas de RT-qPCR: o método denominado tradicional, que utiliza transcrição reversa alvo-específica, e o método que realiza uma pré-amplificação dos transcritos de RNA, denominado sistema Advanced, conforme a nomenclatura do kit comercial. O sistema Advanced apresentou resultados superiores para miR-7, com valores de Ct (Threshold cycle) abaixo de 30, enquanto no sistema tradicional os valores de Ct ficaram próximos de 35, valor considerado limitante para a precisão do qPCR. As expressões de miR-7 e miR-19b foram significativamente maiores no grupo TCSREMi em comparação ao grupo controle, com valores de acurácia (área sob a curva, AUC) de AUC = 0,93 (P = 0,0176) e AUC = 0,89 (P = 0,025), respectivamente, conforme determinado pela metodologia da curva ROC (Receiver Operating Characteristics). A análise combinada de miR-7 e miR-19b, como assinatura de microRNAs, também mostrou acurácia satisfatória (AUC = 0,86, P = 0,0374). Em conclusão, nosso estudo demonstrou que é crucial e viável aprimorar as etapas de purificação e RT-qPCR para melhorar a qualidade da quantificação de microRNAs no soro de indivíduos com TCSREMi. A metodologia de purificação com tiocianato de guanidina apresentou rendimento superior na extração de RNAs presentes no soro, assim como o sistema de amplificação 'Advanced' permitiu a obtenção de Ct adequados, especialmente para microRNAs menos abundantes, como o miR-7. Os dois alvos estudados, miR-7 e miR-19b, isoladamente ou em conjunto, calibrados por miR-21 e cel-miR-39, demonstraram expressão diferenciada de microRNAs em indivíduos com TCSREMi em comparação aos indivíduos controle. Testes subsequentes em uma nova coorte, com maior número de indivíduos, devem ser conduzidos para validar essa assinatura promissora de microRNAs, com o objetivo de identificar indivíduos com expressão diferenciada de microRNAs no TCSREMi. Além disso, esses novos testes também irão avaliar se miR-7 e miR-19b podem servir como biomarcadores precisos para a fenoconversão de TCSREMi em distúrbios neurodegenerativos, como a Doença de Parkinson, a demência por corpos de Lewy e a Atrofia de múltiplos sistemas.