L-asparaginase de Penicillium sizovae, produção nativa e heteróloga

Abstract

A enzima L-asparaginase (L-ASNase) foi a primeira enzima terapêutica descoberta e é utilizada no tratamento de leucemia Linfoblástica aguda (LLA). Seu mecanismo de ação consiste em catalisar a hidrólise da L-asparagina em L-ácido aspártico e amônia. Apesar de ser a primeira linha de tratamento para a LLA, ainda não existe produção de L-ASNase no Brasil. Além disso, todos as formulações de L-ASNase aprovadas e disponíveis no mercado são de origem bacteriana (de Escherichia coli nativa e peguilada, e de Dickeya dadantii), entretanto estas formulações podem causar toxicidade e hipersensibilidade em alguns pacientes. Visando a produção de uma LASNase com efeitos adversos menores e maior rendimento, este trabalho tem como objetivo a investigação da L-ASNase do fungo Penicillium sizovae, isolado a partir do solo do cerrado. Duas abordagens foram avaliadas neste trabalho: a enzima nativa e a enzima heteróloga, expressa em sistema E. coli BL21(DE3). A produção da enzima nativa foi avaliada considerando condições de baixo custo e menor impacto ambiental, com uso de sistemas aquosos bifásicos (SABs) para a purificação. O SAB escolhido foi composto por PEG-2000/tampão fosfato, com fator de purificação (FP) de 1,63, dentre as condições avaliadas. Posteriormente, a cromatografia de troca iônica foi empregada, com rendimento de até 33,66% e FP de até 8,49. Em relação à enzima recombinante, sua clonagem e expressão em E. coli BL21(DE3) foram confirmadas por PCR, SDS-PAGE e Western Blot, ensaios que também confirmaram a presença enzima majoritariamente nas frações insolúveis, sugerindo a formação de corpos de inclusão (CI). As condições de cultivo, incluindo concentração de indutor, tempo pósindução e temperatura de indução foram otimizadas. Ensaios de solubilização com hidrocloreto de guanidina (GdnHCl) foram conduzidos, sendo a condição de cultivo de 0,1 mM de IPTG, 2 h, 37 ºC e 3 M de GdnHCl se destacou quanto à concentração de proteína e tamanho da banda correspondente à L-ASNase em SDS-PAGE. Matrizes experimentais com a finalidade de encontrar aditivos adequados para o redobramento foram realizadas, obtendo-se a enzima em tetrâmero após a adição de cátions divalentes, entretanto, sem atividade catalítica. Avaliações da construção do plasmídeo, do vetor, da linhagem celular e da expressão devem ser realizadas para que a enzima apresente atividade enzimática.