Construção de interruptores genéticos baseados em serina integrases para controle da expressão gênica em células de mamíferos

Abstract

As serina integrases são proteínas de bacteriófagos responsáveis pela integração do DNA viral no genoma bacteriano. Essa inserção ocorre por meio de uma sequência denominada attP (phago attachment site), com o DNA bacteriano em um sítio denominado attB (bacterial attachment site). Após a recombinação mediada pela integrase, o DNA viral é incorporado ao genoma da bactéria, os sítios são mesclados, e os novos sítios attL (left attachment site) e attR (right attachement site) são formados. Quando os sítios attB e attP são posicionados em sentidos opostos flanqueando uma sequência gênica de interesse, os sítios reconhecidos pela serina integrase faz uma inversão da sequência, ou seja, realiza um giro de 180° no DNA que se encontra entre os dois sítios, resultando na posição reverso complementar à inicial. Diversas serina integrases já foram utilizadas para controlar um gene repórter em células procarióticas. No entanto, a utilização de integrases em células eucarióticas como ferramenta para regulação da expressão gênica ainda é limitada. Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar a funcionalidade de seis integrases no controle da expressão gênica em células de mamíferos, visando a construção de um interruptor genético. Células de fibroblastos de pele bovina foram transfectadas com as seis integrases (Int2, Int4, Int5, Int7, Int9 e Int13) em um sistema de cotransfecção plasmidial, como segue: um vetor de expressão da integrase nomeado como pIE e um segundo vetor contendo a sequência codificadora (CDS) do gene repórter gfp em orientação reverso complementar, flanqueado pelos sítios attB/attP da respectiva integrase, intitulado pSG. Após a cotransfecção, as células foram incubadas durante 48 h e acúmulo de GFP foi avaliada por meio de microscopia de fluorescência e mensurada por citometria de fluxo. A inversão da CDS foi amplificada por meio da PCR e confirmada por sequenciamento do tipo Sanger. A florescência da GFP foi detectada por microscopia e citometria para Int9 e Int13. além disso, o sequenciamento evidenciou a correta inversão do gfp e a formação dos sítios attL/attR previstos para todas as integrases avaliadas.