Construção e caracterização de mutantes de cryptococcus neoformans com deleção de genes das vias biossíntéticas de fosfatidilcolina

Abstract

Os fosfolipídios são moléculas fundamentais para a estrutura e função da membrana plasmática de células eucarióticas e procarióticas, além de estarem envolvidos no processo de adaptação ao meio ambiente e sinalização celular. Atualmente, diversos estudos exploram as vias de biossíntese de fosfolipídios como potencial alvo terapêutico contra fungos patogênicos, sendo assim, esse estudo teve por objetivo investigar o papel das vias de biossíntese de fosfatidilcolina na virulência do fungo Cryptococcus neoformans, através da construção e caracterização de mutantes deletados para os genes OPI3 e PCT1 que codificam as enzimas das vias CDP-DAG e Kennedy, respectivamente. Os mutantes foram obtidos através de técnicas moleculares de deleção gênica por Double Joint-Polymerase Chain Reaction (DJ-PCR) e biobalística, e submetidos a testes fenotípicos para avaliar os principais atributos associados à virulência de C. neoformans. O mutante com deleção do gene OPI3, da via de novo, possui crescimento significativamente afetado na ausência de colina no meio de cultura, enquanto o duplo mutante para as duas vias, opi3Δpct1Δ, consegue crescer apenas na presença de extrato de levedura, ou em ágar gema de ovo, possivelmente pela assimilação de substratos utilizados por uma terceira via. Ambos os mutantes induzem cápsulas polissacarídicas maiores que o selvagem KN99α, enquanto em testes de sucetibilidade a antifúngicos, o mutante pct1Δ apresentou maior suscetibilidade aos azóis, fluconazol e itraconazol. Os resultados indicam que essas vias podem estar associadas com mecanismos celulares que regulam a síntese de cápsula polissacarídica, além de papel na virulência e integridade da membrana plasmática.