Expressão de hormônio folículo estimulante bovino (bFSH) com as duas subunidades fusionadas em Pichia Pastoris

Abstract

O hormônio folículo estimulante (FSH) pertence à família das gonadotrofinas. Esse hormônio glicoprotéico é um heterodímero formado pela associação não-covalente de duas subunidades, α e β. As duas subunidades possuem ligações dissulfeto internas e sítios para N-glicosilação. A formação do dímero, com a estruturação quaternária da proteína, é essencial para ligação ao receptor e para a atividade biológica de FSH. O FSH é responsável por uma série de processos reprodutivos, como estimulação de funções testiculares e ovarianas, regulação da gametogênese e síntese de estrógeno. O FSH possui aplicações na veterinária, sendo utilizado em processos de transferência de embriões, sincronização de ciclo estral e superovulação de vacas. O rebanho bovino brasileiro é o maior rebanho comercial do mundo, sendo que o Brasil é o maior exportador mundial de carne bovina. Uma das estratégias utilizadas para aumentar a produtividade do gado brasileiro é a tecnologia de transferência de embriões, utilizando FSH. O FSH para uso veterinário é purificado a partir de extratos hipofisários de porcos. Esse método apresenta desvantagens como produtividade, purificação e questões sanitárias. A tecnologia do DNA recombinante poderia superar essas limitações. O sistema de expressão em Pichia pastoris é vantajoso devido à sua manipulação genética fácil e rápida e ao baixo custo e fácil escalonamento da produção. O objetivo deste trabalho foi expressar FSH bovino recombinante (bFSH) em Pichia pastoris. Três construções gênicas foram arquitetadas: 1) fusão βα(bFSH-fus); 2) fusão βα separada por um peptídeo conector (bFSH-L); fusão βα separada pelo peptídeo CTP de gonadotrofina coriônica equína (bFSH-CTP). Os genes foram clonados no vetor de expressão pPIC9 e utilizados para transformação de Pichia pastoris, linhagem GS115. Clones positivos foram selecionados e utilizados para a indução da expressão em frasco. A expressão das proteínas de fusão em frasco foi eficiente, mas o nível de produção foi baixo. A expressão das proteínas em fermentador está sendo otimizada juntamente com a indústria Ouro Fino. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT

Follicle-stimulating hormone (FSH) belongs to the family of gonadotropins. This glycoprotein hormone is a heterodimer of non-covalently associated α and β subunits. There are five intra-chain disulfide bridges in the α-subunit and six in the β, each containing two N-linked oligosaccharides. The association of the two subunits and the structural conformation of the whole molecule are essential for receptor binding and biological activity. FSH is responsible for several reproductive processes such as stimulation of testicular and ovarian functions, regulation of gametogenesis and steroid hormone synthesis. In veterinary medicine, FSH has been used for genetic improvement of cattle, in processes such as embryo transfer, superovulation and estrous cycle synchronization. The Brazilian livestock is very expressive making this country a great meat exporter. One of the strategies used to increase the productivity of Brazilian cattle is the embryo transfer technology. FSH for veterinary use is purified from pig pituitary extracts. This method presents obstacles associated with productivity, purification, and sanitary issues. Recombinant DNA technology can overcome these difficulties by heterologous expression in microbial hosts. The yeast Pichia pastoris expression system shows many advantages as easy genetic manipulation, simple and cheap growth media, and easy scale-up. This work aimed at the production of recombinant bovine FSH (bFSH) in Pichia pastoris. Three constructs were made: 1) direct βα fusion (bFSH-fus); 2) βα fusion separated by a synthetic linker (bFSH-L); 3) βα fusion separated by the CTP sequence from equine chorionic gonadotropin (bFSH-CTP). The fusion genes were cloned into pPIC9 expression vector and used for Pichia pastoris (GS115 strain) transformation. Expression of the heterologous proteins was efficiently done in shake-flask cultures, but the protein levels were low. Expression in fermenter cultures has been done together with Ouro Fino industry for the achievement of higher protein expression levels.