Clonagem, expressão heteróloga e citolocalização da metionina aminopeptidase de Trypanosoma cruzi

Abstract

A doença de Chagas, após 100 anos de sua descrição, ainda é considerada uma enfermidade negligenciada e de grande importância social, sendo destacada como uma das doenças mais endêmicas da América Latina. O cenário epidemiológico associado à ausência de quimioterapia adequada tem incentivado programas governamentais de prevenção e controle e influenciado grupos de pesquisadores a buscarem o desenvolvimento de novos fármacos. A linha de pesquisa do nosso grupo visa à identificação e caracterização molecular de proteases como potenciais alvos de drogas, Nesse sentido, este trabalho descreve o estudo de uma metionina aminopeptidase de T.cruzi (MAPTc). MAPTc é uma enzima putativa de 476 resíduos de aminoácidos com a massa molecular esperada de 47 kDa, sendo altamente conservada em cinetoplastídeos. O alinhamento de sequências protéicas de metionina aminopeptidases (MAPs) de humano e de T. cruzi demonstrou identidade reduzida, o que contribui para tornar a MAPTc um alvo promissor para desenvolvimento de drogas. A proteína recombinante foi expressa solúvel e inativa em E.coli BL 21(DE3) e purificada para produção de anticorpos em camundongos. Os soros obtidos após as imunizações foram utilizados nos experimentos de immunoblotting e imunocitolocalização na tentativa de confirmar a expressão da proteína. A expressão da proteína foi confirmada nas formas epimastigotas do parasita e a mesma parece estar localizada no citoplasma. Para verificar a atividade de MAPTc, foram realizados ensaios enzimáticos com o substrato fluorogênico MET-AMC. No entanto, não foram alcançados resultados satisfatórios nas condições testadas, indicando que a proteína recombinante foi produzida na sua forma inativa. Testes com TNP470, um inibidor conhecido de metionina aminopeptidases, em formas epimastigotas do parasito, não revelaram um efeito inibitório. Por fim, foi proposto um modelo para MAPTc baseado na estrutura cristalográfica da Metionina Aminopeptidase Humana tipo I, PDB 2B3H.