Diagnose, disseminação e efeitos do complexo viral do alho (Allium sativum L.) em regiões produtoras do Brasil

Abstract

A produção do alho em todo o mundo tem sido afetada por diversos patógenos, dentre eles destaca-se o complexo viral que infecta a cultura causando significativa redução na produção de alho no Brasil. Várias espécies foram identificadas no país, no entanto, os danos causados pelo complexo viral nas células e na fisiologia das plantas infectadas ainda é pouco estudado. São também escassas as informações sobre a ocorrência e prevalência desses patógenos nos diferentes sistemas produtivos de alho no país, estudo que demanda o desenvolvimento de um sistema de detecção viral específico e eficiente. Nesse contexto, o presente trabalho visou desenvolver e adaptar métodos de detecção específicos para as espécies virais do complexo do alho e determinar a ocorrência e prevalência desses patógenos nas regiões produtoras de alho no país. Também foram estudadas as principais alterações fisiológicas morfológicas, bioquímicas e citológicas causadas pelo complexo viral nas plantas infectadas, possibilitando a associação dessas informações com as perdas de produção causadas pela infecção viral. O Capítulo I apresenta uma revisão atualizada dos temas abordados no trabalho com o referencial teórico e as informações científicas disponíveis até o presente. O Capítulo II mostra o desenvolvimento de seis sondas não-radioativas espécie-específicas e uma gênero-específico confeccionadas para a detecção das espécies do complexo viral utilizando hibridização em “Dot-Blot” em membrana de nitrocelulose. Reações de PCR, utilizando primers específicos para as sequencias da CP de seis vírus detectados no país (Potyvirus: Onion yellow dwarf virus- OYDV, Leek yellow stripe virus- LYSV; Allexivirus: Garlic virus C- GarV-C, Garlic virus D- GarV-D e Garlic mite-borne filamentous virus- GarMbFv e Carlavirus: Garlic common latent virus- GarCLV), foram efetuadas para a síntese das sondas específicas marcadas com digoxigenina. Os resultados mostraram que as sondas foram específicas para a detecção do gene da capa protéica de cada espécie viral. Todas as sondas espécie-específicas foram sensíveis para detectar o cDNA do gene da capa protéica de suas respectivas espécies a uma concentração de 0,03 ng/ μL. Entretanto, as mesmas não permitiram a detecção de amostras provenientes de RNA total. Foi demonstrado também, que a técnica de hibridização aumentou a capacidade de visualização dos produtos da PCR auxiliando na maior sensibilidade de detecção dos vírus. Paralelamente ao desenvolvimento das sondas, a técnica de RT-PCR foi desenvolvida para a detecção de amostras provenientes de RNA total, sendo estes resultados, comparados com a detecção sorológica via ELISA. Os resultados obtidos indicaram a maior sensibilidade da RT-PCR na detecção de diversas espécies virais em plantas matrizes provenientes de limpeza clonal, que supostamente deveriam estar livres de vírus. No Capítulo III foi estudada a prevalência e a ocorrência das seis espécies virais em regiões produtoras de alho no Brasil sob diferentes sistemas produtivos. Para isso, amostras de alho foram coletadas nas regiões produtoras para análise via RT-PCR com primers específicos. Os resultados revelaram a ocorrência de Potyvirus (OYDV e LYSV) em todas as regiões. O Carlavirus (GarCLV) ficou restrito as regiões de produção de Cerrado (MG, BA e GO). Em todas as regiões amostradas foi observada, no mínimo, uma espécie de Allexivirus (GarMbFV, GarV-C e GarV-D). A prevalência desses vírus nas regiões produtoras foi relacionada principalmente ao tipo de sistema produtivo e as variedades de alho utilizadas pelos produtores rurais. Foram realizadas avaliações em planta de alho sadias (PS), livres de vírus, e infectadas (PI), com um complexo viral com a finalidade de estudar os efeitos fisiológicos, morfológicos, bioquímicos e citológicos causados pelos vírus. Bulbilhos foram semeados em vasos e 30, 60, 90 dias após plantio (DAP) foram realizadas as avaliações de várias variáveis fisiológicas e bioquímicas durante 3 anos e comparadas estatisticamente. As plantas sadias apresentaram desenvolvimento superior em relação às plantas infectadas. A análise fotossintética revelou que as plantas sadias assimilaram 20% a mais de CO2, do que as plantas infectadas, somente aos 30 DAP. Houve uma redução nos teores de clorofilas a e b, nas três épocas de avaliação, durante os três anos, mas não no teor de carotenóides, para as plantas infectadas. Não se observou diferença significativa na atividade da Rubisco, na produção de açúcares solúveis totais e proteínas totais. A avaliação de amido revelou que as plantas de alho não acumulam amido ou o fazem em baixas concentrações. Este resultado foi confirmado pelas análises citológicas em células de plantas sadias. Além disso, foi observada a presença de aglomerações de compostos lipídicos fora dos cloroplastos normais das células sadias. Em contrapartida, os cloroplastos das células infectadas apresentaram deformação estrutural, acúmulo de substâncias lipídicas, no interior dos mesmos e aumento de volume. Os estudos realizados permitiram desenvolver duas técnicas sensíveis e específicas para auxiliar na diagnose das espécies do complexo viral, determinar a distribuição das espécies do complexo viral prevalente nas regiões produtoras do Brasil em diferentes sistemas produtivos e auxiliar na compreensão das respostas das plantas de alho na ativação de processos metabólicos e possíveis mecanismos envolvidos na defesa contra infecções virais. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT

Garlic production worldwide is affected by several plant pathogens. Among them, viruses represent one of the main pathogens causing significant crop losses. Several virus species were identified infecting garlic in Brazil, however, the damages caused by the viral complex on the physiology of infected plant and on the host responses to virus infection is poorly understood. The occurrence and prevalence of these virus species in the different garlic-growing regions in Brazil is unknown. For this purpose an efficient and specific-detection method is necessary. Based on the lacking of information, this work aimed to develop a specific technique to detect the virus species infecting garlic, to determine the occurrence and prevalence of these species in the country. In addition, the main physiological, biochemical and cytological alterations caused by virus infection in diseased plants were investigated. The Chapter I present an up-to-date review and the state of the art on this topic. The Chapter II shows the development of six non-radioactive virus-specific probes and one potyvirus-specific probe to detect the virus complex by Dot-blot hybridization. PCR reactions using coat protein specific-primers to the viruses detect in Brazil (Potyvirus: Onion yellow dwarf virus- OYDV, Leek yellow stripe virus- LYSV; Allexivirus: Garlic virus C- GarV-C, Garlic virus D- GarV-D and Garlic mite-borne filamentous virus- GarMbFV and Carlavirus: Garlic common latent virus- GarCLV) were performed to obtain virus-specific Dig-labeled probes. The results showed that the probes were able to specifically detect the viruses (cDNA samples) at a concentration of 0,03 ng/μL. However, this efficiency was limited to detect viruses out of total RNA extracts. The hybridization technique was also able to increase the detection capacity of PCR products by gel-hybridization. Simultaneously, the PCR technique was develop to detect samples of total RNA extracts and these results were compared to serological detection by ELISA. PCR was able to detect several viruses even in tissue culture samples, presumable representing virus-free plants. In Chapter III, the prevalence and occurrence of the six virus species in different garlic-growing areas in Brazil were determined. Garlic bulbs were collected in different producing areas and analyzed by RT-PCR with specific primers. The results revealed the occurrence of Potyvirus (OYDV e LYSV) in all regions. The carlavirus (GarCLV) was restricted to the Cerrado area (MG, BA and GO). In all regions sampled at least one Allexivirus species (GarMbFV, GarV-C and GarV-D) was detected. The virus prevalence in the different regions of Brazil was related with the growing system and garlic varieties employed by the growers. Healthy (HP) and infected (IP) garlic plant were studied in order to elucidate the main physiological, biochemical and cytological alterations caused by virus infection. Plants were analyzed at 30, 60 and 90 days after plantio (DAP) and several physiological and biochemical characteristics were determined and compared. Healthy plants showed higher development than infected ones. The photosynthesis analyzes showed that healthy plants assimilated 20% more CO2, than infected plants only at 30 DAP.