Desenvolvimento e testes in vitro de nanopartículas de quitosana para liberação controlada de peptídeos antitumorais

Abstract

As alternativas comuns para o tratamento do câncer têm sido a quimioterapia e a radioterapia apesar destas terapias destruírem células tumorais e não tumorais, sendo necessária a busca por novas alternativas. Entretanto, muitas novas moléculas também podem causar toxicidade em células não tumorais, sendo necessários seus encapsulamentos em sistemas de liberação controlada. Uma das estratégias para a liberação controlada é o uso de nanopartículas com composição e natureza variadas para confinar o composto. O presente estudo tem como objetivo identificar peptídeos com função antitumoral a partir de bibliotecas de sequências (EMBRAPA) de moléculas, encapsular os peptídeos em nanopartícula contendo em sua composição quitosana e desenvolver um sistema de liberação controlada em células tumorais. Foram selecionados dois peptídeos encontrados em anfíbios (H-ALWKDLLKNVGIAAGKAVLNKVTDMVNQ-OH e H-YIGWGYHDY-OH), um fragmento de uma proteína supressora de metástase (H-FINKAGKLQSQLRTTVVAAAAFLDAFQKVA-NH2) e um peptídeo de veneno de abelha, como controle positivo (H-GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ-NH2). Os peptídeos foram sintetizados manualmente pelo método da fase sólida e purificados em RP-HPLC. Tiveram pureza e identidade molecular aferidas em espectrômetro de massa MALDI-TOF/TOF e foram avaliados quanto à eficácia e potência in vitro contra as linhagens de células tumorais B16F10, MCF7, HeLa e HSG e contra a linhagem não tumoral de fibroblasto por meio de ensaio de viabilidade celular (MTT). Foram escolhidos para os ensaios seguintes, um dos peptídeos de anfíbio e a linhagem HeLa, por este peptídeo ter sido mais ativo sobre esta linhagem. Verificou-se que o peptídeo age sobre a membrana da célula e a mitocondrial hiperpolarizando-a. Em seguida, o peptídeo foi encapsulado pelo método de geleificação iônica. Obteve-se eficiência de encapsulamento de 73 e 80% para nanopartículas de quitosana e peptídeo e as de quitosana, polietilenoglicol e peptídeo, respectivamente. As nanopartículas mostraram-se polidispersas, com tamanho médio de 100 a 200 nm, estabilidade coloidal excelente a moderada e de liberação controlada lenta. Estas nanopartículas foram pouco mais ativas sobre a linhagem tumoral HeLa do que o peptídeo livre, apesar de tendo o mesmo resultado sobre a linhagem não tumoral de fibroblasto. Assim, este sistema foi eficiente no encapsulamento do peptídeo podendo vir a ser entregue a alvo específico em estudos posteriores. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT

The common alternatives for the cancer treatment have been chemotherapy and radiation therapies despite these therapies destroy tumor and healthy cells, being necessary to search for new alternatives. However, many new molecules can also cause toxicity in non-tumor cells, requiring their encapsulation in controlled release systems. One strategy for the controlled release is the use of nanoparticles with varied composition and nature to confine the compound. The present study aims to identify peptides with antitumor function from sequence libraries (EMBRAPA) of molecules, encapsulate the peptides in nanoparticles containing chitosan in its composition and develop a controlled release system in tumor cells. We selected two peptides found in amphibians (H-ALWKDLLKNVGIAAGKAVLNKVTDMVNQ-OH and H-YIGWGYHDY-OH), a fragment of a metastasis suppressor protein (H-FINKAGKLQSQLRTTVVAAAAFLDAFQKVA-NH2) and a bee venom peptide, as positive control (H -GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ-NH2). The peptides were synthesized manually by solid phase method and purified by RP-HPLC. Molecular identity and purity were measured in MALDI-TOF/TOF mass spectrometer and were evaluated for efficacy and potency in vitro against B16F10, MCF7, HeLa and HSG tumor cell lines, and against the healthy fibroblast cell line through cell viability test (MTT). For all other experiments, it was chosen a peptide of amphibian and the HeLa cell line due to the fact that this peptide was the more active against this cell line. It was found that the peptide acts on the cell membrane and promote mitochondrial hyperpolarization. Then, the peptide was encapsulated by the ionic gelation method. It was obtained efficiency of encapsulation of 73 and 80% for peptide and chitosan, and chitosan, PEG and peptide nanoparticles, respectively. The nanoparticles were polydisperse, with average size ranging from 100 to 200 nm, exhibited excellent colloidal stability, and moderately slow and controlled release. These nanoparticles were little bit more active on HeLa tumor cell line than free peptide, despite the fact that had the same effect on healthy fibroblast lineage cells. Thus, this system was efficient in encapsulating the peptide that may ultimately be delivered to specific target in future studies.