Isolamento e análise de regiões de cromatina nativa contendo segmentos de DNA na conformação Z em diferentes tipos celulares

Abstract

O Z-DNA é uma estrutura energeticamente desfavorável do DNA que pode ser formada sob certas condições fisiológicas e é conhecida por estar envolvida em uma série de atividades biológicas como a regulação da transcrição. O presente estudo teve como objetivo identificar regiões genômicas em conformação de Z-DNA no genoma humano. Para a pesquisa destas regiões na conformação Z no núcleo da célula, um vetor que contêm informação genética para a expressão de um fragmento de anticorpo que reconhece Z-DNA (pMACIA scFvZ22NLS) foi transfectado em linhagens celulares humanas MCF-7 e A549, anteriormente a imunoprecipitação de cromatina com uso de agente fixador (XChIP) e clonagem. Outra estratégia substituiu a transfecção por um anticorpo monoclonal anti-Z-DNA, em uma estratégia ChIP sem o uso de fixadores (NChIP). Poucas sequências foram recuperadas destes experimentos e foram analisadas conforme seu conteúdo. Análise de dados por ferramentas de bioinformática mostraram três regiões no cromossomo 1 e uma no cromossomo 12 que contêm sequências potenciais formadoras de Z-DNA e foram confirmadas pelos programas Z-Catcher e Z-Hunt. Dentre elas, uma no cromossomo 1 contêm região repetitivas identificadas pelo programa Repeat Masker do tipo SINE/Alu , e tem similaridade com o segundo intron do gene TMCC2 (transmembrane and coiled-coil domain family 2), que codifica a proteína cerebral n.11. A quantificação, por meio da PCR quantitativa em tempo Real, dos fragmentos recuperados pela estratégia de ChIP, revelou que independente do tipo celular, na mesma região, a recuperação foi estatisticamente igual, porém a estratégia ChIP livre de formaldeído recuperou uma maior quantidade de cada sequência formadora de Z. Estes dados sugerem a presença de sequências potenciais formadoras de Z-DNA que podem ser investigadas como potenciais elementos regulatórios. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT

Left handed Z-DNA is an energetically unfavorable DNA structure that could be formed under certain physiological conditions and is involved in a number of cellular actives, such as transcription regulation. The present study focuses on identifying the distributions of Z-DNA regions in the human genome. To search for Z-DNA regions in the cell nucleus, a vector that codes for an antibody fragment that recognize Z-DNA (pMACIA scFvZ22NLS) was transfected into human cancers MCF7 and A549 cell lines, prior to a chromatin immunoprecipitation with fixeR agent (XChIP) and cloning approach. Another strategy used a monoclonal antibody against Z-DNA in a ChIP without fixer agents (NChIP). Few sequences were recovered from these experiments and they were analyzed for their nucleotide sequences. Bioinformatics analysis pointed three regions at chromosome 1 and one at chromosome 12 that presented potential Z- regions and these results were corroborated by the Z-Hunt and Z-Catcher softwares. Among them, one located at human chromosome 1, identified by the Repeat Masker software for harboring SINE/Alu repetitive elements, has similarity with the second intronic region of the TMCC2 (transmembrane and coiled-coil domain family 2) gene, which encondes for the cerebral protein n. 11. The quantification, through Real time quantitative PCR, of the fragments recovered by ChIP strategy, revealed that independently of cell type the Z-DNA conformation was present in the same region of the genome. The recovery of these segments was statistically similar in both strategies used; nevertheless the one free from formaldehyde ChIP recovered quantitatively most sequences. These data suggest the presence of physiologically relevant Z-DNA forming sequences in the human genome which may potentially play a role as regulatory elements. Hence, further investigations to determine its function are required.