Mecanismo de ação do receptor do hormônio tireoideano Beta 1 : caracterização molecular e funcional da região de dobradiça e influência do receptor do ácido 9-cis retinóico

Abstract

Os receptores do hormônio tireoideano (TRs) são proteínas constituídas pelos seguintes domínios: amino-terminal, domínio de ligação ao DNA (DBD) e o domínio de ligação ao ligante (LBD). A região que conecta o DBD ao LBD supostamente age como uma dobradiça. O TR se liga ao DNA como homodímeros ou heterodímeros tendo como parceiro o receptor do ácido 9-cis retinóico (RXR). Estes dímeros pré-formados se ligam aos elementos responsivos (TREs) independente da orientação das bases AGGTCA. O TR reconhece três diferentes TREs: repetições diretas (DR-4: AGGTCAN4AGGTCA); palíndromos (TREpal: AGGTCATGACCT) e palíndromos invertidos (F2: TGACCTN6AGGTCA). Desta forma, para que os receptores se liguem especificamente aos TREs em diferentes orientações, especula-se a necessidade que os DBDs girem em até 180 graus em relação aos LBDs. Para isto, a região que conecta o DBD ao LBD deve atuar como uma dobradiça permitindo tal movimento de rotação. Com o objetivo de investigar qual região corresponderia à dobradiça foram realizadas mutações em diferentes regiões do TRβ1, região T-box (aminoácidos 175 a 180) e alça que conecta as hélices 1 e 2 do LBD (aminoácidos 233 a 238), e do RXRα, região T-box (aminoácidos 201 a 209) e alça que conecta o final do DBD a primeira hélice do LBD (aminoácidos 225 a 232). Foram realizados ensaios de ligação proteína-DNA utilizando proteínas sintetizadas in vitro TR e RXR, nativo e mutantes, marcados ou não com 35S-metionina, e oligonucleotídeos sintéticos contendo os diferentes TREs: DR4, TREpal e F2. Para o estudo funcional foram realizados ensaios de co-transfecção em células U937 e COS-1 com vetores de expressão para o TR e/ou RXR, nativos e mutantes, e plasmídeos contendo cada um dos elementos responsivos (DR-4, F2, TREpal ou DR-1) associados ao gene repórter da luciferase. Embora as mutações na região T-box do TR tenham influenciado a capacidade do receptor em se ligar ao DNA, principalmente como homodímero, e tenha reduzido drasticamente a atividade transcricional em F2, nós sugerimos que essa não seja a região de dobradiça, e sim uma região importante para a ligação de homodímeros. As outras regiões estudadas no TR e/ou RXR não influenciaram a ligação dos receptores aos diferentes TREs e a ativação da transcrição em resposta ao T3, sugerindo que estas regiões não atuem como uma dobradiça nestes receptores. Como os resultados com a deleção da região T-box do TR sugeriram que há uma ligação preferencial aos diferentes TREs, mais especificamente de homodímeros em F2, nós analisamos se o aumento dos níveis intracelulares de RXR poderia exercer um efeito modulatório seletivo em cada elemento responsivo em resposta ao T3. Para verificar essa possibilidade, foram realizados experimentos de co-transfecção e gene repórter em células U937. A co-transfecção de RXR inibiu a resposta mediada por T3 em F2 e TREpal, mas não em DR-4. Nós analisamos se esse efeito ocorria pela ligação direta de heterodímeros ao DNA, pelo seqüestro de co-ativadores em solução ou pelo seqüestro de TR em solução. Nossos resultados demonstraram que dependendo do contexto do DNA, o RXR exerce um efeito modulatório sobre o mecanismo de ação do TR. Em F2, esse efeito aparentemente ocorre de forma indireta pelo seqüestro de TR em solução diminuindo a sua disponibilidade para se ligar como homodímeros nesse elemento responsivo. Por outro lado, em TREpal o efeito modulatório se daria tanto pela ligação direta de heterodímeros ao DNA, quanto indireta pelo seqüestro de TR em solução, ambos devido ao fato deste elemento responsivo ser o sítio preferencial para a ligação de monômeros. ________________________________________________________________________________ ABSTRACT

Thyroid hormone receptors (TRs) are proteins comprised by modular domains: aminoterminal domain, DNA-binding domain (DBD) and ligand-binding domain (LBD). The region that connects the DBD to LBD is supposed act as a hinge. The TR binds to DNA, as homodimers or heterodimers, with the 9-cis retinoic acid receptor (RXR). These dimers pre-formed binding to responsive elements (TREs) independent of the bases AGGTCA orientation. TR recognizes three different TREs: direct repeat (DR-4: AGGTCAN4AGGTCA), palindromic (TREpal: AGGTCATGACCT) and inverted palindromic (F2: TGACCCN6AGGTCA). In such a way, for receptors binding specifically in TREs with different orientations, would be necessary that the DBDs must be rotated in respect to the LBDs. Thus, the region that connects the DBD to LBD should act as a hinge. With the aim of investigate which region correspond to the hinge it performed mutations in different regions of the TRβ1 T-box region (amino acids 175 to 180) and the loop that connects the LBD helixes 1 and 2 (amino acids 233 to 238), and of the RXRα T-box region (amino acids 201 to 209) and the loop that connects the end of DBD to the first helix of LBD (amino acids 225 to 232). Eletrophoretic Mobility Shift Assays were performed using translated in vitro proteins TR and RXR, wild type and mutants, labed or not with 35S-methionine, and synthetic oligonucleotides with the different TREs: DR4, F2 and TREpal. For functional study, U937 and COS-1 cells were co-transfected with TR and/or RXR, wild type and mutants, expression vectors and plasmids with each one of the TREs (DR4, F2 or TREpal) associated with a luciferase reporter gene. Even so, the mutations in the TR T-box had influenced the ability of the receptor to binding to DNA, and drastically decreased the transcriptional activity on F2, we suggested that this region not be the hinge, it seems important to the homodimers binding on DNA. The other regions studied in TR and/or RXR not influenced the receptor binding to different TREs and the transcription activation mediated by T3, suggesting that these regions did not act as a hinge in these receptors. As the results with the TR T-box deletion suggested that there is a preferential binding to different TREs, specifically homodimers on F2, we analyzed whether the increase of intracellular levels of RXR could be exert a selective modulator effect in each responsive element in response to T3. To verify this possibility, it performed co-transfections and gene reporter assays in U937 cells. The RXR co-transfection inhibited the response mediated by T3 on F2 and TREpal, but not on DR-4. We analyzed whether this effect occurs by direct binding of heterodimers to DNA, by coactivators sequester in solution or by TR sequester in solution. Our results demonstrated that RXR exerts a modulator effect upon TR action dependent of the DNA context. On F2, this effect apparently occurs in an indirect form by TR sequestration in solution decreasing its availability to binding as homodimers in this responsive element. On the other hand, on TREpal the modulator effect would be by direct binding of heterodimers to DNA, or indirect by TR sequestration in solution, both due as this responsive element to be the preferential site to monomers binding.