Utilização da APEX2 para marcação de proteínas mitocondriais de Plasmodium falciparum associada a predições in silico e data mining

Abstract

A malária possui como agentes etiológicos os protozoários do gênero Plasmodium, sendo que a espécie responsável pelos casos clínicos mais graves é o P. falciparum. Em 2021, foram registrados 247 milhões de casos de malária, sendo que o continente africano foi responsável por, aproximadamente, 95% dos casos. A espécie predominante nesta região é a P. falciparum, responsável pelos sintomas mais graves da doença, além disso, ao longo dos anos são registrados resistência deste parasita aos antimaláricos de referência, tornando uma preocupação sanitária. Dessa forma, estudar o parasita se torna necessário. A fim de compreender melhor uma das organelas essenciais para a sobrevivência do parasita, o presente trabalho objetivou utilizar a APEX2 para marcar, através da biotinilação, as proteínas mitocondriais de P. falciparum. Esta metodologia irá catalisar a reação de biotinilação de proteínas de compartimentos celulares de interesse, permitindo uma análise detalhada e fidedigna do conteúdo proteômico, através do enriquecimento das proteínas biotiniladas, utilizando um substrato (biotina-fenol) e um agente oxidante (peróxido de hidrogênio). O ensaio de biotinilação das proteínas foi realizada após a obtenção de parasitas transfectados com o plasmídeo de expressão epissomal contendo a sequência codificadora para APEX2 fusionada a um peptídeo de trânsito não-consenso de uma proteína mitocondrial. Através da análise por Western Blot e estreptavidina-blot, foi observado que tanto a expressão da HA-APEX2 e marcação por biotinilação ocorreram. No entanto, a citolocalização da APEX2 por imunofluorescência, ocorreu de forma difusa em todo o corpo celular do parasita, portanto, concluiu-se que a HA-APEX2 não foi endereçada à mitocôndria de P. falciparum. Além da mitocôndria, o P. falciparum, possui outra organela plastidial com características plant-like, denominada apicoplasto. Por alguma razão, ainda desconhecida, ambas as organelas apresentam uma inter-relação bioquímica na biossíntese do grupo heme. Por esse motivo, as estratégias de predição in silico e data mining das proteínas mitocondriais e de apicoplasto, foram empregadas para compor os subproteomas preditos de ambas as organelas. No total, foram preditas 708 proteínas mitocondriais e 781 proteínas pertencentes ao apicoplasto de P. falciparum. Após uma comparação entre os bancos de dados, observou-se uma sobreposição de 108 proteínas. Para as proteínas mitocondriais, foram preditas proteínas referentes à cadeia transportadora de elétrons, e para as proteínas de apicoplasto, foram listadas proteínas pertencentes à via de novo de biossíntese de ácidos graxos do tipo II (FASII). Esta análise de bioinformática reforça as evidências amplamente conhecidas, acerca da biologia de ambas as organelas de P. falciparum. Além disso, foram listadas algumas proteínas nas quais já são estudadas para serem potenciais alvos de antimaláricos. Devido a marcação inespecífica da mitocôndria pela HA-APEX2, uma nova sequência está em fase de sub-clonagem para posterior transfecção. O intuito principal da realização das predições de ambas as organelas, está fundamentada nas características já expostas de ambas as organelas. Desse modo, um panorama detalhado acerca das características bioquímicas da mitocôndria e do apicoplasto já foi estabelecido, para auxiliar nas futuras análises proteômicas.