Caracterização in silico e avaliação da atividade anti-hemostática do antígeno 5 da saliva de Rhodnius neglectus, vetor da doença de Chagas

Abstract

Os triatomíneos são insetos hematófagos transmissores do protozoário Trypanosoma cruzi, agente etiológico da doença de Chagas. Sua saliva é rica em compostos que neutralizam as respostas hemostáticas e imunológicas do hospedeiro. O antígeno 5 (Ag5), membro da superfamília CAP, composta por proteínas ricas em resíduos de cisteína (CRISP - cysteine rich secretory proteins), pelo Antígeno 5 e por proteínas relacionadas à patogenicidade em plantas (Pathogenesis-related – PR1), foi relatado na saliva de artrópodes como responsável por causar fortes respostas alérgicas. Este estudo teve como objetivo caracterizar o antígeno 5 salivar de Rhodnius neglectus (RnAg5) através de abordagens de bioinformática, produzir o RnAg5 recombinante e avaliar seu potencial de inibir a hemostasia. Análises in silico foram realizadas para prever a presença de peptídeo sinal, localização celular e modificações pós-traducionais. A estrutura tridimensional (3D) do RnAg5 foi obtida através do servidor Alphafold, e os aminoácidos que compõem epítopos de células B foram preditos com os servidores ElliPro, BepiPred e SeRenDIP. Com a finalidade de priorizar ligantes promissores, foram realizados cálculos de docking molecular, com o servidor web DockThor. Afim de analisar a relação evolutiva de membros da família Ag5, foi realizada análise filogenética. A sequência Ag5 foi clonada no vetor pET100/D-TOPO e expressa em Escherichia coli Rosetta(DE3)pLysS com isopropil B-D-tiogalactopiranosídeo 1 mM a 37ºC e purificada por cromatografia de afinidade de íons metálicos imobilizados. Posteriormente, foram realizados ensaios de coagulação sanguínea e agregação plaquetária na presença do RnAg5 recombinante para avaliar seu potencial inibitório. O RnAg5 demonstrou possuir um peptídeo sinal no N-terminal, sendo putativamente secretado pela via clássica, possuindo sítios de motificação pós-traducional. Visando o RnAg5 como um marcador de exposição a picadas de triatomíneos, foram identificados resíduos de aminoácidos que compõem epítopos lineares e epítopos conformacionais. O docking molecular indicou o fator de ativação de plaquetas, leucotrieno D4 e E4, prostaglandina I2, tromboxano A2 e prostaglandina E2 como potenciais ligantes do RnAg5. O RnAg5 recombinante foi expresso em corpos de inclusão e também na fração solúvel, sendo esse o primeiro estudo em que essa proteína foi expressa na fração solúvel através de sistema heterólogo de expressão procarioto. A expressão da proteína recombinante foi confirmada por western blotting utilizando anticorpo anti-histidina. Apesar do RnAg5 recombinante não ter apresentado atividade anticoagulante ou inibidora da agressão plaquetária nesse estudo, os resultados computacionais abrem perpectivas do seu potencial biotecnológico.