Produção e purificação de L-Asparaginase por fungos filamentosos isolados do Cerrado do Centro-Oeste brasileiro

Abstract

L-asparaginase (ANSase) é uma importante enzima na área farmacêutica utilizada no tratamento da leucemia linfoblástica aguda (LLA) devido à sua capacidade de hidrolisar a L-asparagina, um aminoácido não-essencial sintetizado por células normais, ao contrário das células neoplásicas. Os efeitos adversos das formulações de ASNase estão associados à imunogenicidade da enzima, seus resíduos após hidrólise por proteases, coatividade de glutaminase (GLNase), neurotoxicidade da amônia e sua origem bacteriana, portanto, é importante encontrar novas fontes de microrganismos eucarióticos produtores de ASNase com baixa atividade GLNase. Este trabalho avaliou o potencial biotecnológico de fungos filamentosos isolados de solo e plantas do Cerrado do Centro-Oeste brasileiro para a produção de ASNase. Quarenta isolados foram selecionados para triagem da produção de enzima, dentre os quais três isolados do solo apresentaram altos teores de atividade da ASNase com baixos valores de atividade da GLNase: Penicillium sizovae, Penicillium cerradense e Fusarium proliferatum. A triagem das variáveis que influenciam a produção de ASNase avaliadas por Plackett-Burman Design revelou que produção da enzima de P. sizovae foi reprimida por fontes de carbono, enquanto concentrações mais altas de carbono aumentaram a produção por F. proliferatum. Quanto à extração da proteína, a maceração da biomassa congelada liberou 5 vezes mais enzima das células do que a sonicação. A ASNase de P. sizovae foi parcialmente purificada por cromatografia de gel filtração seguida de troca iônica. A sequência da ASNase de P. sizovae foi identificada (massa molecular 160 kDa), sintetizada nas formas nativa e parcial (exclusão do peptídeo sinal) e expressa em Komagataella phaffii X-33 com vetor pPICZαA, onde sua atividade biológica foi preservada intracelularmente. Este é o primeiro estudo que expressa a ASNase de um fungo filamentoso em uma levedura. Este estudo mostra o potencial dos fungos do Cerrado brasileiro como novas fontes de ASNase com uma possível redução dos efeitos colaterais para a terapia de LLA.