Expandindo o estudo genético de Fonsecaea pedrosoi : o uso de marcadores e transformação biobalística para inativação do gene de triptofano sintase (trpB)

Abstract

A cromoblastomicose (CBM) é uma doença causada por vários fungos demáceos de diferentes gêneros, sendo que Fonsecaea o mais comum isolado clinicamente. Métodos de transformação genética foram descritos recentemente; no entanto, ferramentas moleculares para o estudo funcional de genes têm sido pouco relatadas para esses fungos. Neste trabalho, foi demonstrado que a deleção de genes e a geração do mutante por recombinação homóloga são possíveis para Fonsecaea pedrosoi pelo uso de duas abordagens: uso de PCR de dupla junta para construção de cassete, seguido pela entrega do marcador dividido por transformação biobalística . Por meio de análises in silico, identificamos que F. pedrosoi apresenta o aparato enzimático completo necessário para a biossíntese do triptofano (trp). O gene que codifica uma triptofano sintase trpB – que converte o indole 3 glicerol fosfato e a serina em triptofano – foi interrompido. O mutante auxotrófico ∆trpB pode crescer com suprimento externo de Ltriptofano, mas a germinação, a viabilidade dos conídios e o crescimento radial são defeituosos em comparação com as cepas selvagens e reconstituídas. O uso de 5-FAA para seleção de fenótipos trp- e para contra-seleção de cepas portadoras do gene trp também foi demonstrado. As ferramentas moleculares para o estudo funcional dos genes, aliadas às informações genéticas dos bancos de dados genômicos, aumentam significativamente nosso entendimento da biologia e da patogenicidade dos agentes causadores da CBM.