Identificação e expressão heteróloga de proteínas acessórias do fungo Thermomyces lanuginosus em Komagataella phaffii

Abstract

A dependência por combustíveis fósseis tem fomentado o desenvolvimento de soluções alternativas baseadas em processos biotecnológicos para produção de energia e produtos químicos a partir de fontes renováveis. A biomassa lignocelulósica apresenta grande potencial para geração de biocombustíveis, por exemplo o etanol de segunda geração, e outros bioprodutos como ácidos orgânicos. As celulases, hemicelulases e proteínas com atividade auxiliar são essenciais no processo de liberação dos monômeros de açúcares da biomassa para posterior conversão em produtos de valor agregado. As expansinas, expansinas-like e mono-oxigenases líticas de polissacarídeos (LPMOs) são exemplos de proteínas auxiliares que agem sinergicamente com enzimas lignocelulolíticas para a degradação dos componentes da biomassa. Sendo assim, visando a produção com alto rendimento e a redução de custos destas enzimas, a otimização de sistemas de expressão recombinantes em microrganismos é altamente desejada. Neste trabalho, a sequência de genes que codificam para duas LPMOs (TLPMO1 e TLPMO2) e duas expansinas-like da família cerato plataninas (CP) (TLEX2 e TLEX3) foram buscadas no genoma do fungo termofílico Thermomyces lanuginosus para expressão heteróloga na levedura Komagataella phaffii. As sequências gênicas foram otimizadas e clonadas em vetor de expressão com fatora de secreção (LPMO) e com fator de secreção nativo (expansina-like). Após a transformação genética de K. phaffii, os clones recombinantes foram cultivados em frascos Erlenmeyer e a expressão da proteína heteróloga foi avaliada pelas técnicas de SDS-PAGE e Western-blot. Dentre as expansinas-like, apenas a proteína TLEX2 foi detectada e se apresentou com tamanho próximo de 25 kDa. Apesar de clones recombinantes para TLPMO1 (sob controle do promotor GAP) terem sido obtidos, não houve detecção da proteína recombinante. A expressão de TLPMO1 e TLPMO2 foi então avaliada sob controle do promotor induzível AOX1. Colônias de K. Phaffii com TLPMO1 e TLPMO2 integrados foram obtidas e apenas a expressão da proteína recombinante TLPMO1 com tamanho aproximado de 55 kDa foi confirmada. As proteínas TLEX2 e TLPMO1 expressas foram purificadas por coluna de afinidade His-tag, alcançando a concentração máxima de proteína purificada de 0,017 mg/mL e 4,4 mg/mL, respectivamente. Ensaios de sinergismo com celulases foram realizados com TLEX2, porém a atividade da proteína não foi constatada. A atividade da TLPMO1 foi confirmada por ensaio amplex-RED, que permite a detecção de peróxido de hidrogênio (H2O2) formado pela enzima. Por fim, as proteínas expansina-like e LPMO provenientes de T. lanuginosus são descritas pela primeira vez neste trabalho e apresentam grande potencial em aplicações biotecnológicas.