Novel molecular markers for inference of phylogenetic relationship and differential detection of Moniliophthora perniciosa AND Moniliophthora roreri

Abstract

O cacaueiro (Theobroma cacao) é uma espécie nativa da floresta Amazônica cultivada principalmente na América do Sul e Central, Sudeste Asiático e África Ocidental para a produção do chocolate. Os fungos Moniliophthora perniciosa e M. roreri são os principais patógenos que afetam a produção de cacau na América do Sul e Central. Nessas regiões, a produção foi reduzida drasticamente devido a introdução desses fungos, ocasionando o abandono de áreas ou o desmatamento para a implementação de novos plantios. A introdução desses dois patógenos em outras regiões é uma ameaça para a produção de cacau. O fungo quarentenário M. roreri foi detectado em julho de 2021 em áreas no estado do Acre próximas a fronteira com o Peru. Como a prevenção é a principal estratégia para proteger o cacaueiro de M. perniciosa e M. roreri, protocolos de biossegurança e métodos de detecção precisos e rápidos são essenciais para evitar a entrada e a disseminação de doenças e garantir a rápida erradicação do foco nas áreas. Como um único marcador molecular é insuficiente para a identificação precisa de fungos, a escolha de diferentes regiões genômicas de genes homólogos de cópia única é essencial para evitar a sobreposição de espécies, e consequentemente, permitir a identificação molecular precisa das espécies de Moniliophthora. Além disso, a validação de uma Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) usando iniciadores espécie-específicos possibilita a obtenção de resultados mais rápidos, precisos e eficazes para o monitoramento das espécies de Moniliophthora no cacaueiro. Baseado nessas premissas, esse trabalho visa (i) desenvolver e validar novos marcadores moleculares para estudos filogenéticos de Moniliophthora spp.; e (ii) desenvolver e validar iniciadores espécie-específicos para rápida e fácil detecção de M. perniciosa e M. roreri. Os isolados de M. roreri foram coletados em Manabí-Equador enquanto os isolados de M. perniciosa foram obtidos dos estados do Amazonas, Bahia e Pará-Brasil para o sequenciamento dos marcadores moleculares ITS, LNS2, MCM7, RPB1, RPB2, TEF1-α, TEF3 e TOPI. Após o alinhamento das sequências de cada região genômica, três e quatro combinações de iniciadores foram testadas para amplificar a região ITS e LNS2, respectivamente. As oito regiões genômicas analisadas não possuem variação intraespecífica entre os isolados e possibilitam a separação de M. perniciosa e M. roreri. Os iniciadores espécie-específicos da região ITS amplificaram isolados de M. perniciosa e M. roreri, enquanto os iniciadores espécie-específicos da região LNS2 amplificaram somente isolados de M. roreri. Um protocolo baseado nos primers desenvolvidos nesse trabalho permitem uma identificação rápida e precisa de M. perniciosa e M. roreri, auxiliando na prevenção dos prejuízos causados pela vassoura de bruxa e monilíase do cacaueiro. Portanto, essas ferramentas podem ser utilizadas em programas de vigilância internacional e planos de contingenciamento para o monitoramento da sanidade do cacaueiro.