Construção de um vetor integrativo em múltiplas cópias para Saccharomyces cerevisiae utilizando seqüências delta

Abstract

Atualmente, o mercado tornou-se favorável para a produção de etanol a partir de biomassa. E o Brasil já tem considerável experiência na produção de bioetanol a partir de cana-de-açúcar, no entanto ela é uma planta sazonal e requer terra de plantio de alta qualidade para seu crescimento. Como substrato alternativo para produção de etanol no Brasil a baixo custo, temos a mandioca. O grupo de biotecnologia molecular da UnB possui uma linha de pesquisa que visa diminuir os custos da produção de etanol a partir de amido de mandioca. Em 1995, Moraes et al. construiu oito linhagens de Saccharomyces cerevisiae capazes de converter amido a etanol, no entanto o vetor utilizado nas construções é epissomal e por não ser estável pode ser facilmente perdido durante o processo industrial onde há o stress ambiental e competição entre as linhagens. Para reverter este quadro, este trabalho visou a construção de um vetor integrativo baseado na seqüência δ do transposon Ty de Saccharomyces cerevisiae no qual foram inseridos os cassetes de expressão de α-amilase de Bacillus subtilis e glicoamilase de Aspergillus awamori, gerando três diferentes vetores: pTA (contendo o cassete da α-amilase), pTGA (contendo o cassete da glicoamilase) e pTAGA (contendo ambos os cassetes). A linhagem semi-industrial MFL e a linhagem industrial JP1 foram transformadas com os vetores construídos. Foram encontrados cinco clones positivos para atividade amilolítica nas transformações da MFL e dois na JP1, a baixa eficiência de seleção de transformantes deve-se ao fato de a marca de seleção não estar inserida no vetor integrativo. As curvas de crescimento dos clones positivos mostraram que não houve alterações no crescimento das linhagens após integração dos vetores e os testes de atividade enzimática mostraram que os clones estão produzindo as enzimas de interesse. Além disso, os testes de estabilidade mitótica mostraram alta estabilidade do vetor nos clones positivos da linhagem JP1, o que torna este sistema de expressão atrativo para produção industrial. ________________________________________________________________________________ ABSTRACT

At present, the market became favorable for ethanol production from biomass. And Brazil already has considerable experience in the bioethanol production from sugar-cane, however it is a seasonal plant and it requires land of planting of high quality for his growth. As alternative substrate for low cost ethanol production in Brazil, we have the cassava. The molecular biotechnology group of UnB has a line of research that aims to reduce the costs of ethanol production from cassava starch . In 1995, Moraes et al. built eight Saccharomyces cerevisiae strains able to convert starch to ethanol, however the vector used in this constructions is epissomal and because of not being stable it can be easily lost during the industrial process where there is the environmental stress and competition between strains. To revert this picture, this work aimed the construction of an integrative vector based on sequence δ of the Saccharomyces cerevisiae transposon Ty in which the cassettes of expression of Bacillus subtilis α-amilase and Aspergillus awamori glicoamilase were inserted, resulting three different vectors: pTA (containing the cassette of α-amilase), pTGA (containing the cassette of the glicoamilase) and pTAGA (containing both cassettes). The semi-industrial strain MFL and the industrial strain JP1 were transformed by these vectors. Five positive clones were found with amylolytic activity in the MFL transformations and two in the JP1, the low selection efficiency of positive clones is due to the fact that the selection mark wasnt inserted in the integrative vector. The positive clones growth curves showed that there were no alterations in the strains growth after vectors integration and the tests of enzymatic activity showed that the clones are producing the enzymes of interest. Moreover, the mitotic stabilitys tests showed high stability of the vector in the positive clones of the strain JP1, which makes this system of expression attractive for industrial production.