Enriquecimento de proteínas parceiras de KAHRP e mapeamento de proteínas organelares de Plasmodium falciparum utilizando CRISPR-Cas9, APEX2 e proteômica

Abstract

A malária é uma doença tropical, causada por espécies do gênero Plasmodium spp. O Plasmodium falciparum é a espécie mais virulenta, pois é a única capaz de produzir o quadro clínico mais grave da doença: a malária cerebral. De acordo com as últimas estimativas, cerca de 229 milhões de pessoas são acometidas pela malária, e, estudos que possam viabilizar a descoberta de novos alvos terapêuticos se tornam altamente necessários, haja vista aos crescentes casos de resistência aos antimaláricos disponíveis. Neste sentido, a fim de poder explorar melhor os parceiros de interação com a proteína KAHRP (do inglês, knob-associated histidine rich protein), uma proteína relacionada à citoaderência ao endotélio do hospedeiro humano facilitando a formação de “rosetas” em P. falciparum, foi implementado o uso de CRISPR-Cas9 juntamente com a abordagem de marcação por proximidade mediada por ascorbato-peroxidase modificada (APEX2), a fim de criar uma proteína quimérica da KAHRP fusionada a APEX2 por knock-in, utilizando o sistema CRISPR-Cas9, com a finalidade de promover a biotinilação de proteínas vizinhas parceiras. Para avaliar a funcionalidade da proteína quimérica KAHRP-Flag-APEX2 , ensaios de validação por Western-blot, estreptavidina-blot e imunofluorescência foram realizados. As análises de proteômica e de bioinformática revelaram que dentre as 208 proteínas do parasita biotiniladas vizinhas da KAHRP-Flag-APEX2, algumas delas são preditas por serem exportadas pelo translocon PTEX presente na membrana do vacúolo parasitóforo, e, outras preditas por serem exportadas por mecanismos não clássicos. Dentre as proteínas observadas, encontramos: GBP130, PTP2, membros do grupo PHISTb, UIS2, Pf332, RESA, as proteínas que compõe o complexo RhopH/CLAG (RhopH1/CLAG3.1, RhopH2 e RhopH3) e do complexo PTEX: PTEX88 e 150. Adicionalmente, seguindo o princípio da acurácia e proximidade proporcionada pelo uso da APEX2, construções similares foram realizadas, a fim de endereçar a HA-APEX2 para algumas organelas de P. falciparum. Pelo fato do parasita apresentar organelas especializadas, tais como o apicoplasto e as roptrias, o conhecimento do arsenal de proteínas presentes nestas estruturas, podem fornecer evidências para que futuras estratégias para a erradicação da doença, baseado no desenvolvimento de quimioterápicos e/ou vacinas sejam realizadas. O uso da APEX2 tem se mostrado altamente eficiente nesse quesito, pois permite uma descrição altamente precisa acerca das proteínas presentes em uma organela de interesse, baseando-se na sua resolução temporal

e espacial. Assim, construções epissomais foram adicionalmente obtidas, endereçando a HA- APEX2 para o apicoplasto (pCC1-SP(ACP)-HA-APEX2), a mitocôndria (pCC1-SP(TrxR)-HA-APEX2) e

as roptrias (pCC1-SP(RAP1)-HA-APEX2). O controle citosólico também foi obtido (pCC1-HA(cito)- APEX2). Com a mudança da metodologia de transfecção com o uso da plataforma Amaxa II Nucleofector II AAD-1001N (Lonza) e a determinação da ineficácia da droga anti-folato WR99210 proveniente da Sigma-Aldrich para selecionar os parasitas mutantes por [3H] hipoxantina, a obtenção dos parasitas transfectados foi possível após 3-4 semanas de seleção. Os ensaios de validação da expressão e da marcação por biotinilação propiciada pela APEX2 por Western-blot e estreptavidina-blot dos respectivos compartimentos estão em andamento.