Avaliação da toxicidade aguda e crônica dos fármacos psiquiátricos (nortriptilina e venlafaxina) em peixe-zebra (Danio rerio) utilizando abordagens tradicionais e genômicas

Abstract

Na última década, novas substâncias começaram a aparecer em concentrações quantificáveis nos ecossistemas aquáticos. Estas substâncias, conhecidas como contaminantes emergentes, incluem os fármacos psiquiátricos, medicamentos estes que se encontram entre os mais prescritos mundialmente. Com isso, a presença deles no meio ambiente eleva-se a cada ano. Atualmente, os possíveis efeitos nocivos dos fármacos psiquiátricos em organismos não-alvo são motivos de preocupação por parte da comunidade científica e menos de um terço dessas substâncias apresentam estudos ecotoxicológicos, sendo que mais escassas ainda são as pesquisas que avaliam os efeitos crônicos desses fármacos nos ambientes aquáticos em baixas concentrações. Nesse contexto, o objetivo deste trabalho foi avaliar o potencial nocivo de dois fármacos psiquiátricos antidepressivos amplamente utilizados, a nortriptilina (NTP) e a venlafaxina (VLX), que estão presentes em matrizes aquáticas, e que apresentam informação ecotoxicológica limitada. Para este fim utilizamos diferentes estágios de vida do peixe-zebra (Danio rerio), embrio-larval e adulto, para realizar exposições agudas e crônicas, avaliando múltiplos parâmetros de toxicidade. A exposição aguda à NTP (500; 1100; 2300; 4800; 10300; 22000; 46900 μg/L) no teste de toxicidade com embriões (168 horas), apresentou CL50 de 1800 μg/L no fim do teste; alterou o equilíbrio das larvas: após 96 horas de exposição às concentrações de 1100; 2300; 4800 de NTP; após 144 horas de exposição às concentrações de 500, 1100, 2300 μg/L de NTP; e após 168 horas de exposição à concentração de 1100 μg/L de NTP. A exposição das larvas à NTP reduziu a frequência cardíaca após 48 horas de exposição à concentração de 10300 μg/L de NTP. Apresentaram diminuição da atividade da enzima acetilcolinesterase as larvas expostas: à concentração de 500 μg/L de NTP, durante 120 e 144 horas; e às concentrações de 0,088, 1,58 e 500 μg/L de NTP, durantes 168 horas. A exposição à NTP também alterou, nas larvas, o comportamento natatório: após 120 horas de exposição à concentração de 500 μg/L de NTP; após 144 horas de exposição à concentração de 0,006, 0,088, 28,12 e 500 μg/L de NTP; e após 168 horas de exposição à concentração de 28,12 e 500 μg/L de NTP. A exposição aguda (96 horas), de peixes adultos, às concentrações de 500, 600, 800, 1100, 1400, 1800 e 2000 μg/L de NTP, apresentou CL50 de 1100 μg/L, ao final do experimento e induziu a diminuição da atividade da enzima acetilcolinesterase nos peixes expostos às concentrações de 500, 600, 800, 1100 μg/L, mas não danos no DNA pela avaliação pelo teste do cometa e micronúcleo. A exposição crônica (28 dias), de peixes adultos, às concentrações de 0,1 e 10 μg/L de NTP, não induziu mortalidade, genotoxicidade, alteração na atividade da acetilcolinesterase e alterações histopatológicas nos rins, brânquias e fígado, mas foi capaz de alterar o comportamento natatório dos animais expostos à concentração 10 μg/L de NTP, levando ao aumento na frequência de permanência na camada superior do aquário nesses animais expostos, em comparação com o controle. Nessa mesma exposição, a análise genômica por microarray, das amostras cerebrais, identificou 243 genes diferencialmente expressos nos grupos expostos em comparação ao grupo controle: sessenta e seis genes entre o grupo controle e os animais expostos à concentração de 0,1 μg/L de NTP e 184 genes são exclusivos entre o grupo controle e os animais expostos à concentração de 10 μg/L de NTP. As principais vias

gênicas alteradas na concentração de 0,1 μg/L de NTP estão associadas com oxidorredução, transportadores de íon cálcio e fatores de transcrição; enquanto que na concentração de 10 μg/L de NTP, os principais genes alterados estão relacionados com processos de oxirredução, transporte transmembrana de íons, sistema imunológico, metabolismo mitocondrial e comportamento locomotor. No estudo de toxicidade da VLX, a exposição a esse fármaco (100000; 177900; 237300; 316400; 421800; 562500; 750000; 1000000 μg/L) no teste de toxicidade em embriões, durante 168 horas, apresentou CL50 de 274100 μg/L ao final do experimento; antecipou a eclosão dos ovos nas concentrações de 100000 e 117900 μg/L; alterou o equilíbrio das larvas após 96 horas de exposição às concentrações de 100000; 237300; 316400; 421800 e 562500 μg/L de VLX; após 120 horas de exposição às concentrações de 316400; 421800 e 562500 μg/L de VLX; após 144 horas de exposição às concentrações de 316400 e 421800 μg/L de VLX; e após 168 horas de exposição às concentrações de 237300 e 316400 μg/L de VLX. No teste de toxicidade com embriões a exposição à VLX também reduziu a frequência cardíaca, das larvas, após 48 horas de exposição às concentrações de 237300; 316400; 421800 e 562500 μg/L. Larvas apresentaram diminuição na atividade das enzimas: acetilcolinesterase (após exposição às concentrações de 1000, 25000 e 100000 μg/L de VLX), glutationa S-transferase (após exposição às concentrações de 2, 1000 e 25000 μg/L de VLX) e aumento na atividade da enzima lactato desidrogenase (após exposição à concentração de 100000 μg/L de VLX). A exposição aguda (96 horas), de peixes adultos, às concentrações de 1000, 25000, 50000, 75000 e 100000 μg/L de VLX: apresentou CL50 superior a 100000 μg/L ao final do experimento; e, nas amostras de cabeça: foi capaz de causar a diminuição na atividade da enzima glutationa-S-transferase (após exposição às concentrações de 25000, 50000 e 100000 μg/L de VLX) e aumento na atividade da enzima lactato desidrogenase (após exposição à concentração de 100000 μg/L de VLX); e nas amostras musculares, causou o aumento na atividade da enzima glutationa-S-transferase (após exposição à concentração de 100000 μg/L). Tal exposição aguda, não se mostrou genotóxica pelas avaliações do teste do cometa e micronúcleo. A exposição crônica (28 dias), de peixes adultos, às concentrações de 0,2 e 1000 μg/L de VLX, não induziu mortalidade e genotoxicidade, mas alterou a atividade dos biomarcadores enzimáticos: aumentou a atividade das enzimas glutationa-S-transferase (após exposição à concentração de 0,2 μg/L de VLX) e lactato desidrogenase (após exposição à concentração de 0,2 e 1000 μg/L de VLX), nas amostras da cabeça. Avaliações morfométricas revelaram que, tal exposição crônica, causou no intestino redução na altura do epitélio, após exposição à concentração de 1000 μg/L de VLX; e, após exposição à concentração de 0,2 e 1000 μg/L de VLX causou redução na largura e na altura das vilosidades intestinais, além da redução do tamanho das lamelas secundárias das brânquias. A exposição crônica, à concentração de 1000 μg/L de VLX, também foi capaz de alterar o comportamento locomotor: causou redução na velocidade máxima de nado e aumento no tempo gasto e na distância percorrida na área superior do aquário pelos animais. Após essa exposição, a análise genômica por microarray, das amostras cerebrais, mostrou que 80 genes estavam diferencialmente expressos nos grupos tratados em comparação ao grupo controle, dos quais 60 são entre o

controle e os animais expostos à concentração de 0,2 μg/L de VLX e 43 genes são entre o controle e os animais expostos à concentração de 1000 μg/L de VLX, sendo que para esses dois grupos expostos as principais vias gênicas alteradas estão associadas com atividade locomotora e ciclo circadiano. De maneira geral, a exposição à NTP se revelou mais tóxica em comparação com a exposição à VLX ao organismo-modelo, no teste com embriões e adultos, mas os dois antidepressivos em concentrações baixas, inclusive ambientalmente relevantes, apresentaram efeitos tóxicos nas larvas (causando comprometimento da atividade de enzimas biomarcadores e a alteração do padrão locomotor) e em peixes adultos (causando desregulação da expressão de genes). Além disso, após exposição crônica (à concentração de 10 μg/L de NTP e à concentração de 1000 μg/L de VLX), os dois fármacos causaram fenótipo semelhante: provocaram um comportamento locomotor mais relaxado de nado, indicando que ambas as exposições são capazes de alterar comportamentos primários de sobrevivência desses animais. Os resultados aqui apresentados são inéditos na literatura e contribuem para um melhor entendimento do efeito tóxico dos fármacos psiquiátricos descartados no meio ambiente em organismos não-alvo.