Effects of long cooling periods of the ear skin on the isolation and cultivation of bovine fibroblasts for use in nuclear transfer technique

Abstract

O armazenamento e transporte de amostras de animais que vieram a óbito ou estão localizados em fazendas distantes de laboratórios por longos períodos de tempo constitui uma realidade. A necessidade de um protocolo eficiente de armazenamento e transporte destas amostras para a manutenção da viabilidade tecidual do animal de interesse existe, e para tal, as orelhas de oito fêmeas bovinas foram coletadas no momento do óbito, lavadas, tricotomizadas e armazenadas por 30 dias a 5oC. Nos dias 0, 2, 4, 7, 14, 21 e 30, o cultivo de explantes de pele foi realizado. Em comparação aos diferentes períodos de refrigeração, o tempo para o aparecimento das primeiras células ao redor dos explantes, tempo até confluência, concentração celular no momento do congelamento, taxa de contaminação e viabilidade celular foram observados. Um aumento no tempo de aparecimento dos primeiros fibroblastos foi observado com o aumento do tempo de refrigeração, onde no dia 0, as células levaram 4±0 para aparecer ao redor dos explantes enquanto no dia 30, elas cresceram apenas com 33.5±1.5 dias. Um aumento também ocorreu no tempo até confluência celular com períodos de refrigeração mais longos. Células do dia 0 levaram 24±2 dias para atingir confluência enquanto células do dia 30 atingiram confluência com 31±0 dias. Contaminação foi mais prevalente em períodos posteriores (14, 21 e 30) e a concentração celular caiu drasticamente com o aumento do período de resfriamento, caindo de 1.334.375±131.375cel/mL no dia 0 para 311.250±0cell/mL no dia 30. De igual maneira, a viabilidade celular diminuiu de 85,6±1,7% no dia 0 para apenas 28,72±4,81% no dia 30. Quando células refrigeradas a 5°C por 30 dias foram utilizadas como doadoras de núcleo a técnica de transferência nuclear, uma taxa de blastocisto de 26.05% em D7 foi obtida, uma boa taxa de blastocisto para um longo períodos de refrigeração. Foi observado que a refrigeração de tecido viabiliza a cultura celular para transferência nuclear por longos períodos de refrigeração de amostra. No entanto, o aumento no tempo de armazenamento acarreta danos celulares, dificultando o cultivo, diminuindo consideravelmente a viabilidade celular pós- descongelamento e a concentração celular, mas mantendo a capacidade celular como doadora de núcleo para a produção de embriões clones.